10923ES 通用型一步法无缝克隆试剂盒(用于同源重组)
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企业简介
翌圣生物科技（上海）股份有限公司【Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd.】是一家以蛋白质改造和酶进化技术为驱动，聚焦生命科学产业链上游核心原料，从事分子、蛋白和细胞三大品类生物试剂的研发、生产与销售的高新技术企业，通过打通分子酶、蛋白、抗体、核酸、细胞的技术开发路径，成为国内少数同时覆盖三大品类生物试剂、兼备核心技术自主研发能力和规模化生产能力的高新技术企业，产品广泛应用于生命科学研究领域、诊断与检测领域和生物医药领域。
主营业务
公司凭借在蛋白质改造和酶进化领域的技术优势和深耕生物试剂行业多年积累的丰富经验，构建了品质优良、类型齐全、种类丰富的产品管线。自公司成立以来，公司研发、生产和销售的生物试剂超过3000种，涵盖分子、蛋白、细胞三大品类的生物试剂，能够满足客户多种类型生物试剂的一体化采购需求。公司核心产品覆盖qPCR系列、NGS系列、逆转录系列、核酸提取与纯化系列、PCR系列、分子克隆系列、体外转录系列、抗体、蛋白纯化系列、蛋白分析系列、重组蛋白、细胞分析系列、细胞培养系列、细胞转染系列、报告基因检测系列等多个品类的生物试剂，广泛应用于生命科学研究、诊断检测和生物医药等领域。
发展历程
荣誉资质
翌圣生物通过申请商标和软件著作权的方式保障核心技术和市场竞争力，不断加强公司品牌建设。截至2022年3月31日，公司已经获得授权18项（其中发明14项、实用新型1项、外观设计3项）和45项与生物试剂相关的软件著作权，拥有经国家知识产权局商标局核准的注册商标权37项以及4项境外注册商标，是国家高新技术企业和上海市专精特新企业。
创新平台
经过多年的产品研发技术经验的沉淀以及持续的研发创新，翌圣生物积极开展“产学研”合作，与拥有生物催化与酶领域国家重点实验室的湖北大学、拥有教育部工业生物领域重点研究基地的江南大学展开合作，优化生物试剂关键原料的生产和表达工艺。翌圣生物以基因工程技术、生物信息技术、细胞生物学技术、免疫学技术、生化分析技术等生命科学领域的共性生物技术为基础，建立了六大核心技术平台——双向分子酶理性设计与定向进化平台、密度发酵与超洁净纯化平台、分子诊断试剂关键原料研发平台、高通量测序建库试剂创新研发平台、高性能单克隆抗体研发平台和mRNA医药应用研发平台，目前已经自主研发出20项核心技术，打通分子酶、蛋白、抗体、核酸、细胞的技术开发路径，覆盖技术研发、产品升级、规模生产和质量控制等生物试剂研发和生产的各关键环节。
工业化生产
翌圣生物拥有按照准GMP 标准建设运营的工业化生产基地，配有吨级发酵线、工业级 AKTA 纯化线和全自动包装线。同时，公司通过了ISO 13485:2016质量管理体系认证，从原料控制、生产管理、质检管控、仓储运输等对生产线进行360度管理监督，保证产品过程的可控制性及可追溯性，竭尽全力为您提供可靠的产品。
客户服务
翌圣生物凭借优质稳定的产品质量、高效及时的响应能力、快速稳定的交付能力和周到完备的售后服务获得了众多科研用户和工业用户的认可，为检测公司、治疗公司、工具类公司和科学研究实验室提供应用于科学研究、体外诊断、基因测序、生物医药等的生物试剂。与中国科学院、清华大学、北京大学、复旦大学、上海交通大学、浙江大学等顶尖科研院所和华大基因、恒瑞医药、药明康德、之江生物、圣湘生物、斯微生物、金斯瑞、思路迪等工业客户建立了稳定、紧密的合作关系，公司产品被多次使用在Nature、Science、Cell等国际顶级期刊论文发表中。
公司企业文化
帮助客户创造价值，让世界更健康更快乐
◎ 成为生命科学工具领域全球Top⑩
◎ 具备驱动产业变革的技术创新能力
◎ 拥有一支持续学习型的翌圣铁军
翌圣生物始终秉承“帮助客户创造价值，让世界更健康更快乐”的使命，专注于技术创新和产品升级，不断拓展核心技术的应用领域，为客户提供更为的产品与服务，助力我国打造自主可控的生物试剂产业链。同时，翌圣生物将进一步推进国际化战略，继续布局和拓展海外市场，为全球生物试剂产业发展贡献力量。
详细信息
Hieff Clone® Universal II One Step Cloning Kit是新一代的同源重组克隆试剂盒，精心优化的第二代2× Hieff Clone® Universal II Enzyme Premix预混了重组酶和重组反应所需缓冲液，并添加了的重组增强因子，用于同源重组可显著提高重组克隆效率。
该试剂盒可以将PCR产物定向克隆至任何载体的任何位点，兼容未纯化PCR产物、直接回收的PCR产物、低浓度的胶回收产物，本产品可重组同源臂GC含量30%-70%的接头片段。将载体线性化，并在插入片段正、反向PCR引物5’端引入15-25 bp的线性化载体末端同源序列，使得插入片段PCR产物5’和3’末端分别带有与线性化载体两末端对应的一致的序列。PCR产物和线性化载体在重组酶的作用下，在50℃条件下最快仅需5 min即可完成重组反应。克隆阳性率可达95%以上。
组分信息
组分编号 | 组分名称 | 10923ES05 | 10923ES20 | 10923ES50 |
10923-A | 2 × Hieff Clone® Universal II Enzyme Premix | 50 μL | 200 μL | 500 μL |
10923-B | 500 bp control insert (25 ng/μL) | 5 μL | 5 μL | 5 μL |
10923-C | pUC 19 control vector, linearized (50 ng/μL) | 5 μL | 5 μL | 5 μL |
储存条件
-25~-15℃保存，有效期1年。
简版使用说明
1.重组反应
1)线性化载体和插入片段使用量
Hieff Clone®重组反应体系各个片段及载体插入总浓度为0.02 - 1 pmol。载体与各个插入片段摩尔比为1:2*。对应的DNA质量可由以下公式计算获得：
pmol = (插入片段使用量ng) × 1,000 / (插入碱基对数 × 650 daltons)
50 ng 5,000 bp的DNA片段约为0.015 pmol
50 ng 500 bp的DNA片段约为0.15 pmol
*当插入片段长度大于载体时，最适载体与插入片段使用量的计算方式应互换，即插入片段当做载体，载体当做插入片段进行计算。线性化载体及插入片段的反应终浓度可达到1 ng/μL。线性化载体和插入片段扩增产物未纯化直接使用时，使用总体积应不超过反应体系体积的1/5，如20 μL体系不超过4 μL。
简便的投入量计算公式：插入片段投入量=2×插入片段长度×插入载体投入质量/载体长度
2)重组反应体系（可等比扩大或缩减反应体系，冰上配制，各组分使用前需混匀）
组分 | 重组反应体系 |
2× Hieff Clone® Universal II Enzyme Premix | 10 μL |
每个插入片段投入量 | X |
目的载体投入量 | Y |
ddH2O | To 20 μL |
表1 反应体系
3)重组反应条件
体系配制完成后，用移液器轻轻吸打混匀各组分，短暂离心将反应液收集至管底。
当插入1个片段时，反应条件为50℃，5 min；当插入片段数为2-6个时，建议反应条件为50℃，10 -50 min（反应时间随片段数增多而延长，如表2所示）。超长载体片段连接，建议反应时间为40-60 min。
连接片段数 | 重组反应时间 |
2 | 10 min |
3 | 20 min |
4 | 30 min |
5 | 40 min |
6 | 50 min |
表2 反应时间
反应产物可直接进行转化，也可储存于-20℃，待需要时解冻转化。
转化
提前15分钟将用到的筛选培养基平板拿到37℃预热。
在冰上解冻快速克隆感受态细胞（如：DH5α Fast Chemically Competent Cell，Cat#11803ES）。
取10 μL冷却重组产物，加入到100 μL感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置5 min。
用200 μL移液枪将上一步的混合物转移到已经37℃预热的LB培养基上，均匀涂布。
将平板置于37℃培养箱倒置过夜培养。若进行蓝白斑筛选操作，平板在37℃至少倒置培养15 h。
克隆鉴定
快捷的方法是菌落PCR。用无菌的枪头或牙签将单个菌落挑至菌落PCR Mix中混匀（如：2×Hieff® Ultra-Rapid HotStart PCR Master Mix (with Dye)，Cat#10157ES），加入引物直接进行PCR反应。推荐至少使用一条通用测序引物进行菌落PCR，可以避免PCR假阳性的产生。后续也可用于酶切或测序鉴定。
注意事项
1.需自备的材料：
1)自备样品：自备好线性化载体和插入片段。
2)自备试剂（仅罗列部分）：
超级感受态：转化效率＞108 cfu/μg，如翌圣DH5α快速化学感受态细胞（Cat#11803ES）。
高保真酶：2× Hieff Canace® AdvanceFast PCR Master Mix (With Dye)（Cat#10164ES）或其他等效产品。
菌落PCR mix：2× Hieff® Ultra-Rapid HotStart PCR Master Mix (with Dye)（Cat#10157ES）或其他等效产品。
核酸染料：YeaRed Nucleic Acid Gel Stain (10,000× in Water)（Cat#10202ES）或其他等效产品。
3）自备仪器耗材（仅罗列部分）：PCR仪，水平电泳槽，切胶仪，EP管等。
2. 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。
3. 本产品仅作科研用途！
