近年来伴随着精准医学的发展，个性化新疗法，特别是基因治疗已成为其中发展潜力的治疗方向之一。

基因治疗（Gene Therapy）是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿缺陷和异常基因，从而达到疾病治疗的目的。按照使用的核酸不同，又可以分为基于DNA和基于RNA两大类。基于DNA的主要有CAR-T细胞和CRISPR基因编辑的离体基因治疗，体内基因编辑(CRISPR等)和递送基因片段（质粒、病毒等载体）的在体基因治疗。基于RNA的主要有反义寡核苷酸（ASO）、RNA干扰（siRNA、miRNA）、基因激活（saRNA）、mRNA和RNA编辑（CRISPR）。

本期#封面故事专题我们主要会聚焦分子量较大的基于DNA治疗和mRNA治疗过程中的色谱技术方案。

mRNA的质量控制

由于mRNA疗法会受到大量RNA酶的降解，从而使mRNA的稳定性受到影响。为了改善mRNA的效率和稳定性，阻止5'核酸酶降解mRNA，现在已经创建了各种帽分子来维持珍贵mRNA序列的生物学稳定性。5'帽的多样性和完整性的分析表征对于分子稳定性和给药安全至关重要。poly A尾是腺苷的重复序列（A），在3'端，该尾巴长度的增加为“核心”序列提供了额外的稳定性，该序列可保证细胞核中mRNA的稳定和细胞质中mRNA的降解，调配mRNA与核糖核蛋白的结合以及随后的宿主免疫反应。鉴于mRNA稳定性的挑战以及当前递送方式的挑战，了解poly A尾降解的情况是改善治疗的重要方式。基于BioZen 2.6µm Oligo（详见P202~203）色谱柱，我们以HPLC方法匹配高分辨率质谱法（HRMS），以区分多种帽子及其相对完整性以及Poly A尾的长度解析。

AAV载体的质控分析

使用腺相关病毒(AAV)作为基因治疗中ssDNA递送的有效载体是主流的一种方式。迄今为止，大约有13种不同的血清型被鉴定出具有一系列共同的氨基酸序列。在结构上，病毒衣壳是由三个衣壳或病毒蛋白(VP)以1:1:10(VP1:VP2:VP3)的比例以非共价组装而成的三角形蛋白质二十面体。考虑到血清型和结构蛋白序列之间的相似性，蛋白质鉴定、相对蛋白比例和翻译后修饰评估是至关重要的。我们使用Biozen Intact XB-C8（详见P212~213）反相色谱柱，通过LC-MS分析AAV5和AAV9中变性和解离的衣壳蛋白。

与任何蛋白质一样，病毒蛋白(vp)也会受到翻译后修饰的影响，从而影响稳定性、衣壳组装和整体功效。因此，肽图谱可用于评估这些修饰的存在和鉴定。Biozen Peptide XB-C18（详见P204）色谱柱具有良好的峰容量和高水平的序列覆盖分离。

LNP原料的质控

脂质纳米粒（LNP）是由可电离脂质制成的球形囊泡，在低pH值下带正电（使RNA络合）和生理pH值下中性（与带正电荷的脂质体相比，减少潜在的毒性作用）。由于其大小和性质，脂质纳米粒可以通过内吞作用被细胞吸收，并且脂质在低pH下的电离性可使内体逃逸，这允许递送物释放到细胞质中。此外，脂质纳米粒通常含有促进细胞结合的辅助脂质，比如填充脂质之间间隙的胆固醇，以及减少血清蛋白调理作用和网状内皮清除的聚乙二醇（PEG）。因此LNP通常有四种成分：辅助脂质、阳离子或可电离脂质，胆固醇和聚乙二醇化脂质。LNP原料的组成对于LNP的形成以及功能具有非常重要的作用。Luna（详见P266~P290）和Kinetex（详见P236~264）色谱柱组合通常会用于LNP原料分析，从而把控好递送的第一关。

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