MAS-QuChERS-LCMSMS法对动物源性食品中利巴韦林的快速检测
时间：2013-03-26 阅读：1017
一.背景：
被曝光违规喂食金刚烷胺、利巴韦林等抗病毒药品的“速生鸡”流入市场，对多家餐饮企业都产生非常大的负面影响。利巴韦林又名病毒唑、三氮唑核苷、尼斯可等，是广谱强效的抗病毒药物，目前广泛应用于病毒性疾病的防治。利巴韦林通常会抑制谷胱甘肽，从而影响红细胞的细胞膜，使氧的红血球细胞溶解，从而可能引起贫血，这也可能恶化已经存在的心脏疾病，另外经动物实验证明利巴韦林还有致畸性、致癌性和生殖毒性等。
鉴于利巴韦林会在动物组织中有残留，所以政府有关部门开始禁止使用利巴韦林等防治高致病性禽流感等一类病原微生物引起的病毒性疫病。我国对于动物源性食品中利巴韦林残留含量的相关研究报道属于空白，也未曾制定或立项过国家标准、行业标准，上也无特定*及相应检测方法。而且经多方面验证目前还没有准确合适的检测方法。
利巴韦林是弱碱性的极性小分子，易溶于水，所以本实验采用水和乙腈的混合溶液提取鸡肉中的利巴韦林。经实验证明，离子交换类填料对其吸附不稳定，所以本实验采用MAS-QuChERS方法进行净化处理，利用MAS填料直接吸附鸡肉提取液中的杂质，利用LC-MS/MS检测技术建立了动物源性食品中的利巴韦林的快速检测方法。
| 化合物名称 | 英文名 | 结构式 | CAS编号 |
| 利巴韦林 | Ribavirin Granules | 36791-04-5 |
二.实验部分
2.1仪器与试剂
API 4000+质谱检测器，配液相色谱仪；高速离心机；涡旋振荡混合仪；超声波振荡器；氮气浓缩仪。
利巴韦林MAS净化管；利巴韦林标准品（纯度99%）。甲醇、乙腈 （色谱纯，博纳艾杰尔科技）、甲酸（色谱级）、实验用水为超纯水；一次性无菌注射器（博纳艾杰尔科技）；针式过滤器（0.22μm，直径13mm博纳艾杰尔科技）。
2.2 溶液的配制
标准储备溶液：准确称取利巴韦林标准品适量，用超纯水溶解并定容配制成1mg/mL。
标准工作液：用超纯水稀释至合适浓度。
2.3 样品的提取和净化
酶解前处理方法：准确称取1g（至0.01g）均质好的鸡肉至 50 mL 离心管中，加入5mL10mmol/L乙酸铵溶液（pH=4.8）和20ul磷酸酯酶，涡旋混合2min，于37℃下酶解2h，取出冷却至室温，8000r/min离心5min，取全部上清液加入10ml乙腈，涡旋1min后8000r/min离心5min，取5mL上清液加入MAS净化管中，涡旋1min后8000r/min离心5min，取全部上清液于50℃氮气吹干后，用1mL水复溶过0.22μm滤膜，待测。
2.4 样品的检测
2.4.1 色谱条件
色谱柱：Venusil MP C18（2.1*150mm，5μm，100Å）；
流动相：0.1%甲酸水溶液-甲醇=95:5
流速：200μL/min；
柱温：30℃；
进样量：5μL；
2.4.2 质谱条件
电离模式：电喷雾电离正模式；检测方式：多反应监测（MRM）；离子源温度（TEM）：550℃，Curtian Gas: 10，Ion Source Gas 1: 70，Ion Source Gas 2:75
表1 质谱参数
| 化合物 | 保留时间/min | Q1 | Q3 | Decluster Potential | Collision Energy |
| 利巴韦林 | 3.36 | 245.4 | 113.0 | 53 | 39 |
| 96.2 | 53 | 13 |
2.5 实验结果
2.5.1 方法线性关系和定量限
分别添加利巴韦林标准溶液至均质好的鸡肉中，使其形成浓度分别为5ug/kg、10ug/kg、20ug/kg、50ug/kg、100ug/kg的基质添加样品，在通过2.2所述方法提取净化后检测，以检测得到的峰面积，以样品添加浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标拟合其线性方程，按照S/N=10计算得到该方法的zui低定量限。
| 物质名称 | 回归方程 | 相关系数 | zui低定量限（S/N=10） |
| 利巴韦林 | Y=2285.5x-1991.5 | 0.9984 | 5ug/kg |
表2 线性和检出限
图1 10ug/kg标准品谱图
2.5.2 方法的稳定性
在均质好的鸡肉中添加利巴韦林标准品溶液使其形成10ug/kg的基质添加样品，按照上述方法在相同的条件下检测，按照测得的利巴韦林的出峰时间及峰面积的值计算该方法的稳定性。
表3 方法稳定性
| 编号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | RSDn=5 ，% |
| 保留时间（min） | 3.43 | 3.41 | 3.43 | 3.41 | 3.39 | 0.49 |
| 峰面积 | 23384 | 21983 | 22346 | 23155 | 24198 | 1.39 |
图2 10ug/kg鸡肉加标谱图
2.5.3 准确度与精密度
以均质好的空白净化后溶液加标实验证明该方法基质对目标物检测存在影响，所以在实际样品检测过程中，以空白净化后溶液加标为基础计算样品添加的回收率。
分别在均质好的鸡肉中添加利巴韦林标准品溶液使其分别称为含有5ug/kg和20ug/kg的基质添加样品，按照上述方法净化、检测后，测得的该方法的准确性结果如下。
表4 基质添加实验结果与稳定性
| 添加浓度 | 1 | 2 | 3 | RSDn=3 |
| 5ug/kg | 78% | 87% | 95% | 9.6% |
| 20ug/kg | 75% | 70% | 79% | 6.0% |
图3 鸡肉空白谱图
2.6 订货信息
| 产品名称 | 规格型号 | 货号 | 报价 |
| 利巴韦林MAS净化管 | 15mL，50/PK | MS-LBWL01 | 980 |
| Venusil MP C18 | 2.1*150mm，5μm，100Å | VA951502-0 | 3300 |
| 针式过滤器PTFE | 0.22μm，直径13mm,200/PK | AS081320 | 800 |
| 一次性无菌注射器 | 5mL,100/pk | ZSQ-5ML | 90 |
| 乙腈 | 4L/瓶 | AH015-4 | 330 |
| 甲醇 | 4L/瓶 | AH230-4 | 120 |