登革热IgG检测试剂
预定用途：
Panbio登革热IgG捕获ELISA法是用来定量检测二次感染登革热病毒（1~4型）IgG抗体的方法。可以作为诊断二次感染登革热的临床实验室检测辅助手段，能与登革热IgM捕获ELISA法联合应用来鉴别初次感染或是二次感染。这个方法仅能用来检测具有临床登革热症状的病人的样本。阳性结果必须经病毒分离、双份血清分析、免疫组织化学检测抗原或病毒核酸检测证实有登革热病毒感染。
序言：
登革热病毒是一种黄病毒属，广泛存在于热带和亚热带地区。世界上一半人口生活在这些地区，处在登革热传染的危险之下。就其引起人类的发病率和死亡率来论，登革热已成为zui重要节肢动物疾病。有4种不同的、但在抗原学上相关的登革热病毒类型。它通过雌性蚊子，特别是埃及伊蚊、白纹伊蚊和波利尼西亚伊蚊来传播。
登革热病毒感染的临床表现多种多样，从亚临床症状到死亡。根据疾病的严重程度可以分级如下：非特异性热性疾病、典型的登革热、登革出血热（DHF）（I级和II级）和登革休克综合症（III 级和IV级）。典型的登革热表现为突然发热伴随着两种或更多种的症状：头痛、后眼眶痛、肌痛、关节痛、出疹、出血表现以及白细胞减少症。双相热型、失眠和由于味觉丧失或苦味引起的食欲不振都很常见。DHF和DSS很严重，是经常伴随着第二种血清型感染而出现的可能会致死的并发症。
在登革热流行的那些国家，大多数病人会有二次感染。抗体的检测有助于诊断，特别是二次和继后的感染，那时并发症的发生率很高。一般地，血凝反应-抑制（HAI）滴度用来分类初次感染或是二次感染。目前结果的确定依赖于至少7天内及时分离得来的配对血清样本的分析，HAI滴度≥ 1:2560的急性样本确定为来自第二次黄病毒属感染的病人。然而，根据HAI分类登革热病例的普遍适用性由于血凝素在不同实验室的可变性而受到了质疑。
Panbio登革热IgG捕获ELISA法是一种替代HAI分析登革热二次感染血清学诊断的有效方法，因为它通过使用标准物校准减少了登革热血清在实验室间的变异。不像HAI，不需要用丙酮萃取血清，如果得到了阳性结果，血清也无须出院后获得。登革热二次感染表现为感染发作后1~2天出现可检测的高IgG水平，这可能伴随有IgM水平的升高。高IgG水平（>22Panbio单位）因此作为登革热病毒二次感染的标志。
原理：
血清IgG抗体和包埋在微孔板测试带（测定板）聚苯乙烯表面的抗-人IgG抗体相结合。在每个含有登革热病毒抗原（1~4型）的抗原瓶中加入抗原重组缓冲液。在重组抗原中加入相同体积的辣根过氧化物酶（HRP）-结合单克隆抗体（MAb）,形成抗原-Mab复合物。冲洗走测定板上的残存血清，加入复合的抗原-Mab。然后抗原-Mab复合物和血清登革热-特定IgG抗体结合。孵育后，冲洗微孔板，再加入无色底物，四甲基联苯胺/过氧化氢TMB/H2O2。底物被HRP水解，如果有的话，那色原体就会变成蓝色。用酸终止反应后，TMB变成黄色。颜色的变化是测试样本中存在抗-登革热IgG抗体的标志。
提供的材料：
1．抗-人IgG-包埋的微孔板-（绿色的测定板）（12＊8个孔）。备用。没有用过的微孔应立即重新密封好，贮存在有干燥剂的地方。在2-8ºC稳定至失效。
2．装在瓶中的稳定的登革热抗原-1、2、3、4型登革热病毒抗原冻干在小瓶中。没有用过的冻干的抗原应该贮存在2-8ºC。重组抗原能冷冻保存和解冻一次。冻干抗原在2-8ºC稳定至失效。
3．洗涤缓冲浓缩液-一瓶60ml装，吐温20和防腐剂（0.1% ProclinTM）20倍浓缩的磷酸盐缓冲盐水pH 7.2-7.6。[在低温下可能会形成结晶。为避免这种情况，把它放在37度直至变得透明。充分混匀。]在1份洗涤缓冲浓缩液加入19份蒸馏水稀释。稀释的缓冲液在2~25ºC可以贮存一个星期。
4．血清稀释液-两瓶50ml装（粉红色）。备用。三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水pH 7.2-7.6 含防腐剂（0.1% Proclin）和添加剂。在2~8度保持稳定直至失效。
5．抗原重组缓冲液-一瓶7ml装（透明色）。备用。缓冲液含有防腐剂（0.1% Proclin）和蛋白稳定剂。在2~8ºC保持稳定直至失效。
6．辣根过氧化物酶结合单克隆抗体示踪剂-一瓶7ml装（绿色）。备用。辣根过氧化物酶结合单克隆抗体示踪剂含防腐剂（0.1% Proclin.）和蛋白稳定剂。在2~8ºC保持稳定直至失效。
7．四甲基联苯胺 TMB-一瓶15ml装。备用。3,3,5,5''-TMB和枸酸盐缓冲液（pH 3.5-3.8）内的过氧化氢的混合物。在2~8ºC保持稳定直至失效。
8．IgG反应对照血清-一个红色有盖的瓶子装有200µL人血清（含有0.1%叠氮化纳和0.005%硫酸霉素）。在2~8ºC保持稳定直至失效。
9．IgG标准血清-一个黄色有盖瓶子装有400µL人血清（内含0.1%叠氮化纳和0.005%硫酸霉素）。在2~8ºC保持稳定直至失效。
10．IgG阴性对照血清-一个绿色有盖的瓶子装有200µL人血清（含有0.1%叠氮化纳和0.005%硫酸霉素）。在2~8ºC保持稳定直至失效。
11．终止液-一个瓶子15ml装。备用。1M磷酸。在2~25ºC保持稳定直至失效。
Proclin. 300是RohmHaas公司的注册商标产品
对照和标准血清安全注意事项：
预警：
在这些成份里叠氮化纳的浓度是有毒性的，是属于下列级别R22, R32的：“吞食有毒”和“和酸接触会释放出有毒气体”
另外必需具备但不提供的材料：
1．精确可调节微量移液器（5-1000µL容量），配备一次性使用吸管
2．去离子水
3．微量培养板洗涤系统
4．酶标仪配备450nm滤波片
5．计时器
6．刻度量筒
7．烧瓶
8．血清稀释用的试管或微量滴定板
警示: 用于体外诊断用
i 用在准备对照时的所有人类来源的材料在测试对人类缺陷性病毒1和2（HIV1和2）、丙型肝炎病毒以及乙型肝炎病毒表面抗原抗体时，都为阴性。但是没有哪种方法能够*保证，所以所有的人体对照和抗原都应该认为是潜在的感染源。疾病预防控制中心和国家健康署建议可能传染的抗原应该在2级生物安全下进行处理。
ii 这种测试只能用血清。用全血、血浆或是其它的样本间质不能做。
iii 黄疸的或黄体脂蛋白血清，或表现出溶血的，或有细菌生长的血清都不可用。
iv 不要加热失活的血清。
v 在开始实验前，所有的试剂必须要平衡至室温（20~25ºC）。试验受到室温变化的影响。只有达到了室温才能把微孔板从密封包里拿出来。
vi 用干净的枪头直接在瓶子里配试剂。转移试剂可能会导致污染。
vii 未用过的微孔板，应立即重新封存，并储存有干燥剂的地方。如果不这样做可能会造成错误的结果。
viii 底物系统
a 由于TMB易受金属离子污染影响,所以不允许底物系统和金属表面接触。
b 避免长时间暴露于阳光直射下。
c 一些洗涤剂可能会干扰TMB的表现。
d TMB可能会有一些淡蓝色。这个不会影响底物的活性或者试验的结果.
警告
为获得更多的安全信息请参照从PANBI0得到的原料安全数据表（MSDS）.
标本收集和准备
让静脉血在室温下（20~25ºC）凝结成块，然后根据全国临床实验标准委员会NCCLS（收集诊断静脉血的认可标准程序，H3-A4, 1998）进行离心。
血清应尽快分离并冷藏（2~8ºC），如果在两天内不试验的话，就应该冷冻（-20ºC或更低的温度）。不推荐使用自我解冻的致冷机。黄疸血清、有溶血的、脂血的或是有细菌生长的血清都不推荐使用。CLSI提供贮存血样的建议。（血样处理加工的认可标准程序，H18-A2, 1999）。
测试程序：
注意：确保在实验前，所有的试剂都平衡至室温（20~25ºC）。在超出所提供的时间和温度范围内试验可能会导致无效的结果。没有在即定的时间和温度内进行的试验应重复一次。
血清预稀释：
i 从箔袋内拿出所需数量的微孔板，并插入夹板固定器。5个板分别是阴性对照、阳性对照和三个标准物。确保剩下未用的微孔板紧紧地密封在箔袋内。
ii 用合适的试管或微量滴定板稀释阳性对照，阴性对照，标准物和病人样品。
a 在10µL血清中加入1000µL血清稀释液。充分混匀。或者
b 在10µL血清中加入90µL血清稀释液。取出20µL稀释的血清加入180µL血清稀释液。充分混匀。
EELISA操作步骤：
对方法的概括参见附图
a 稳定的抗原瓶。
i 从试剂盒内取出所需的冻干抗原瓶。每瓶可足够2条带16个孔使用。在每瓶内各加入1ml的抗原重组缓冲液。混匀确保抗原溶解。如果完好的重组抗原没有用过，将它保存在-80ºC直至所需。确保剩下没用的重组抗原贮存在2~8ºC。
ii 取出所需量的重组抗原，然后在一个干净的玻璃或塑料瓶里混合相同体积的MAb 示踪剂。轻轻地混匀抗原和MAb示踪剂溶液，再在室温下保持至所需时。为测试板总量微孔准备足够的抗原瓶，也即每瓶抗原可够16个孔（2条带）使用。
b 测试板
i 混匀后10分钟内，吸取100µL稀释的病人样本和对照，分别加入测试板相应的微孔内。
ii 盖上测试板，在37°C±1°C孵育1小时。
iii 用稀释的洗涤缓冲液冲洗6次。（参见下面的冲洗步骤）。
iv 混匀抗原和MAb示踪剂。吸取100 µL混匀物，加入测试板相应的孔内。
v 盖上测试板，在37°C±1°C孵育1小时。
vi 用稀释的洗涤缓冲液冲洗6次。（参见下面的冲洗步骤）。
vii 在每个孔内加入100 µL TMB。
viii 从*次加入算起，在室温下20-25°C 孵育10分钟。将会出现蓝色。
ix 按TMB加入的时间和顺序，在所有的孔内加入100 µL终止液。混匀。蓝色将会变成黄色。
x 30分钟内读数，波长450nm，参照滤波器600~650nm。
注意：如果是双波长分光光度计，在600~650nm间设定参照滤波。如果在450nm读数没有参照滤波时，可能会由于背景因素出现更高的吸光值。
冲洗步骤：
有效的冲洗能去除没有混合的样品或成分，这对于ELISA程序是很有必要。
A．全自动冲洗板
1 吸光所有孔内容物。
2 在冲洗过程中，洗涤缓冲液要注满孔（350 µL）
3 6次冲洗完后，把板翻转，在吸水纸上用力敲打确保去除所有的冲洗缓冲液。
4 全自动冲洗板一定要维护好，确保冲洗效果。在所有时间内都要遵照制造商的冲洗说明。
B. 人工冲洗
1 把内容物倒入合适的废物缸。
2 用一个合适的挤压瓶把洗涤缓冲液加满孔，避免起泡，因为这可能会降低冲洗效果。立即倒掉缓冲液。
3 重新加满，再立即倒掉。
4 再重复4次步骤3。总共用洗涤缓冲液洗6次。
5 洗完zui后一次后，倒掉孔内容物，把板翻转，在吸水纸上用力敲打确保去除所有的冲洗缓冲液。
质量控制：
每个试剂盒包括标准物，阳性对照和阴性对照血清。在随附的说明表列有这些血清合适值。那阴性和阳性对照是用来监测由试剂引起的失败。阳性对照不能确保试验临界点的精确度。如果对照或标准的吸光度值没有达到说明书标准，则测试无效，就应该重做。如果测试无效，病人结果就不能报告。质量控制需要必须遵照当地的、州和/或国家法律或委任书和你们实验室标准质量程序。
建议用户参照NCLSI C24-A和42 CFR 493.1202c中的合适的质量控制实践指导。
计算：
1 计算三个标准物的平均吸光度值。这是临界值。
2 样品的吸光度除以临界值就得到指数值。
或者
3 指数值乘以10就得到Panbio 单位。
指数值=样品的吸光度/临界值
例如：样品A的吸光度=0.949
样品B的吸光度=0.070
临界值=0.302
样品A 0.949/0.302=3.14指数值
样品B 0.070/0.302=0.23指数值
Panbio 单位=指数值 X 10
样品A 3.14 X 10 = 31.4 Panbio 单位
样品B 0.23 X 10 = 2.3 Panbio 单位
结果解释：
登革热IgG捕获ELISA法检定二次登革热病毒感染病人血清中IgG抗体水平。阳性结果（> 22 Panbio 单位）表明急性二次登革热感染。如果要区分是初次还是二次感染，就应该用到登革热Duo ELISA法。
解释
结果解释
指数 | Panbio单位 | 结果 |
<1.8 | <18 | 阴性 |
1.8 – 2.2 | 18 – 22 | 可疑 |
>2.2 | >22 | 阳性 |
结果 | 解释 |
阴性 | 没有检测到IgG抗体。这结果不能排除登革热感染。如果怀疑有二次感染，就应该在4~7天内对另一个样品重新进行检测。ELISA比率<18的样本可以用登革热IgM捕获ELISA法测定初次登革热病毒感染。 |
可疑 | 可疑样品应重复检测。重复检测后如果结果还是可疑，就应用另外的方法来测试，或采集另一个样品。 |
阳性 | 检测到IgG抗体的存在。表示有急性二次登革热感染。应用其它登革热血清学方法来证实登革热感染。 |
推荐一种报道结果的方法：由Panbio登革热IgG捕获ELISA法得出下列结果。不同方法得出的结果不能互换。测量结果超出临界值不表示现有抗体总量。结果应该报告为阳性、阴性或可疑，而不能报数值。
测试的局限性
1．临床诊断必须根据临床症状和病人体征来解释。从试剂得来的结果不是诊断性的。应该结合临床数据和病人症状来考虑。
2．在不同的地理区域，人群血清流行病学可能会随着时间的改变而变化。因此，那临界值可能需要根据当地的研究进行调整。
3．不能用来做一般人群的筛查。阳性预值依赖于现存在病毒的可能性。只能对有临床症状的病人进行测试，或者有可疑暴露时。
4．和黄病毒属出现血清学交叉反应是常见的事（即在登革热1，2，3，4型和日本脑炎、墨累山谷脑炎、圣路易脑炎、黄热病、西尼罗河病毒等之间）。在确诊前必须排除这些疾病。在做登革热IgG捕获ELISA法的临床试验中，我们观察到IgG水平之间也存在交叉反应，在其它组也有类似的发现。
5．免疫测定中的嗜异染抗体是一种很好识别的干扰原因。这些动物IgG抗体可能会与试剂IgG抗体交叉反应并产生假阳性。这在确诊前也必须被排除。
6．没有为可视的结果确定建立表现特征。
7．这个测定利用昆虫表达蛋白。人类抗-昆虫抗体的交叉反应或干扰对测定结果来说是不可知的。
8．根据Panbio登革热IgG捕获ELISA法，所有的血清都显示为一个阳性结果时，这时应该送交参照实验室进行确定和流行病学记录。
期望值：
登革热二次感染表现为在感染发作后的1~2天特异性IgG水平很高，而且大多数病例还伴有IgM水平的升高。
在一些二次感染中，可检测到的IgG抗体水平可能是低的。一些病人在感染后的头7~10天可能不会产生可检测到水平的抗体。只要症状还存在，我们就建议在*份样本后的4~7天对病人重新进行测试。
性能特征：
在马来群岛的一所大学里，我们用Panbio登革热IgG捕获ELISA法对血凝抑制和内部ELISA法标记的146份回顾性血清进行了测试。这些血清包括30份地方性的血清阴性样本，60份表现为初次登革热感染阳性的血清样本和56份表现为二次登革热感染阳性的样本。结果用来测定该方法的灵敏性，特异性和一致性。数据见表1。
表1 Panbio ELISA血清学灵敏性和特异性与登革热疾病状况的比较
Panbio登革热IgG捕获ELISA法
登革热状况 | 阳性 | 可疑＊ | 阴性 | 总计 |
血清阴性a | 0 | 0 | 30 | 30 |
初次感染 | 0 | 4 | 56 | 60 |
二次感染 | 48 | 7 | 1 | 56 |
总计 | 48 | 11 | 87 | 146 |
＊可疑样本的重测试没有计算在内。
95% CI＊
血清学灵敏性（二次感染）b =48/56 = 85.7% 73.8 – 93.6%
血清学特异性（初次感染）b = 56/60 = 93.3% 83.8 – 98.2%
血清学特异性（血清阴性） = 30/30 = 100.0% 88.4 – 100.0%
血清学一致性b =134/146 = 91.8% 86.1 – 95.7%
a 样品经HAI法（滴度≥2560）检测为二次登革热感染阳性。
b可疑数不包括可疑样本的重测试。（见上＊）
＊CI=可疑区间
重现性：
为了测定Panbio登革热IgG捕获ELISA法试剂盒的重现性，我们用3个批号的试剂盒在不同的3天对8份血清每份进行了3次测试。用方差分析对组内、日间、组间和总的精密度进行了分析。结果见表2。
表2 Panbio登革热IgG捕获ELISA法精密度测定（用指数值＊）
|
|
| 组内 | 日间 | 组间 | 总计 |
样品 | 数量 | 均值＊ | ＊SD CV | ＊SD CV | ＊SD CV | ＊SD CV |
#1 #2 #3 #4 #5 #6 #7 #8 | 27 27 27 27 27 27 27 27 | 3.26 3.82 3.84 1.54 2.29 1.66 0.31 0.84 | 0.11 3.5% 0.13 3.4% 0.14 3.5% 0.05 3.3% 0.11 4.6% 0.07 4.4% 0.03 11.4% 0.07 8.2% | 0.07 2.2% 0.06 1.5% 0.04 1.0% 0.05 3.4% 0.00 0.0% 0.05 2.8% 0.01 3.3% 0.00 0.0% | 0.57 17.6% 0.58 15.3% 0.67 17.5% 0.20 12.9% 0.32 13.8% 0.17 10.1% 0.13 42.3% 0.04 4.7% | 0.50 15.2% 0.51 13.2% 0.58 15.0% 0.18 11.6% 0.28 12.4% 0.16 9.8% 0.11 37.1% 0.08 9.0% |
所有的值都是从指数值计算得来的
SD=标准差； CV=变异系数
注意：由于列表原因，标准差结果保留两位小数
＊样品吸光度除以临界值得到指数值。
交叉反应性：
通过测试一组66份来自其它确诊病人（非登革热）的样品来测定Panbio登革热IgG捕获ELISA法的诊断特异性。那样品来自于患有可能存在交叉反应疾病的病人。测试中的每份样品的Panbio登革热IgG捕获ELISA法分析都要服从于其疾病诊断。结果参见表3。
表3 Panbio登革热IgG捕获ELISA法-交叉反应分析
仅供研究，不作临床诊断！
登革热IgG检测试剂疾病类型 | 样品总量 | 阳性结果 |
类风湿因子 | 10 | 0/10 |
抗核抗体 | 10 | 0/10 |
风疹 | 8 | 0/8 |
Barmah森林病毒 | 9 | 0/9 |
恙虫病 | 9 | 0/9 |
罗斯河病毒 | 10 | 0/10 |
西尼罗河病毒 | 10 | 1/10 |
总计 | 66 | 1/66 |
