Biocoat 血管生成系统：内皮细胞侵袭
时间：2014-03-26 阅读：1782
Biocoat 血管生成系统：内皮细胞侵袭
BD 产品货号：354141、354145、354146
储存和运输：-20度储存，干冰运输。
操作指南：
血管生成过程中，内皮细胞活化后表达基质蛋白酶（MMPs），可降解血管基底膜。BD Biocoat 内皮细胞侵袭系统提供了抗/促血管再生化合物的体外定量实验模型。内皮细胞侵袭系统包括：BD Falcon24多孔培养小室，含配套接收板和盖子；BD fluoroBlok荧光屏蔽3.0μm孔径PET膜，预包被Matrigel基质，具体操作步骤如下：
1 冻融
1.1 从-20℃冰箱中取出包装，使其自然升温到室温。
1.2 在小室内加入0.5ml37℃预热的基本培养基，在37℃CO2环境下冻融15-45分钟，待用。
1.3 冻融后，小心去去除培养基，避免破坏Matrigel基质膜。可用抽吸或倒置培养板并轻拍的方法去除培养基。
2 侵袭实验：用BD钙黄绿素Calcein AM荧光染色剂后标记
细胞侵袭基质膜穿过荧光标记膜后，采用荧光标记定量。
2.1 采用如1.1的步骤冻融，对照板无需冻融。
2.2 胰酶酶解细胞单层，使其悬浮在无血清培养基中，浓度为2.0×105/mL。*的接种细胞浓度需要采用一系列细胞浓度进行优化，包括在下室培养表面的浓度（例如，培养瓶，培养皿和培养板）。例如，接种浓度为105cell/cm2时，采用浓度为0.5×105到5.0×105 cell/cm2的范围确定*的接种浓度。
2.3 在上小室中加入0.25mL的细胞悬浮液（5.0×104 cell/well）。
2.4 通过进样口，快速加入750μl含5%FBS或适量生长因子（比如BDVEGF）的培养基，作为底部小室的化学诱导剂。
2.5 小室和对照小室在37℃，5%CO2环境下培养22±1小时。
3、细胞侵袭能力的测定：用BD钙黄绿素Calcein AM荧光染色剂后标记定量
注意：对于每一个完成得培养板，需要12.5mL的HBSS和50μg的钙黄绿素。HBSS的使用时为了减少荧光染色剂自动水解引起的高背景荧光。
3.1 准备浓度为4μg/mLd 高黄绿素。12.5mL的HBSS37℃预热。50μg高黄绿素用20μLDMSO溶解，加入150μL预热的HBSS。将其转入大量的HBSS中，用150μL预热的HBSS清洗荧光染料的容器。
3.2 孵育后，小心去除上小室中的培养基。注意小心转移邻近小室底部的培养基。可以通知抓住培养板，轻轻拍打，使培养基从下部滴落。避免破坏Matrigel基质膜。
3.3 将培养小室转移到另一块24孔板中，该孔板含有0.5mL每孔的4μg/mL钙黄绿素。在37℃，5%CO2环境下孵育90分钟。
3.4 侵袭小室的荧光定量信息通过荧光板读板机底部读数取得，激发波长494nm，发射波长517nm。只有侵袭并通过Matrigel FluoroBlokTM膜后细胞才能被检测。
注意：后标记所使用的染色剂不局限于胞核染色，比如SYTO-24，在血清培养基环境中具有较低背景，不需要使用第二块板用于标记。
4、侵袭研究：DilC12（3）荧光染色剂预标记法
细胞接种于孔板之前先用于染色剂标记，可用于均一化实验，所得到的实时动力曲线可揭示细胞通过基底膜侵袭的能力，不需要分解和破坏各个时间点。
4.1 如1.1所示冻融。
4.2 不同浓度的各类荧光素对细胞标记的程度不同，标记浓度和时间，接种细胞浓度和化学诱导剂必须先优化。
4.3 胰酶消化细胞单层，制备细胞悬液，溶于无血清DMEM培养基，浓度为2×105cell/mL。*的接种细胞浓度需要采用一系列细胞浓度进行优化，包括在下室培养表面的浓度（例如，培养瓶，培养皿和培养板）。例如，接种浓度为105cell/cm2时，采用浓度为0.5×105到5×105 cell/cm2的范围确定*的接种浓度。
4.4 在上小室中加入0.25mL的细胞悬液（5.0×104cell/小室）。
4.5 通过进样口，快速加入750μL含有5%FBS或适量生长因子（如BD VEGF）的培养基，作为下室的诱导剂。
4.6 小室和对照小室在37℃，5%CO2环境下培养22±1小时。
5、细胞侵袭的计算：用DilC12（3）荧光染色剂后标记定量
侵袭小室的荧光定量信息通过荧光板读板机底部读数取得，激发波长549nm，发射波长565nm。只有侵袭通过Matrigel FluoroBlok膜被标记的细胞才能被检测。
6、结果计算
注意：数据可以用相对荧光值RFU或侵袭百分比表示，后者在标准化数据处理中更有用。
背景扣除：计算平均背景值，将其从各个孔板中扣除。
6.1 侵袭百分比
侵袭百分比%=通过基质膜包被的荧光膜侵袭细胞的平均相对荧光值/通过未包被荧光膜侵袭的平均相对荧光值×100
6.2 信噪比
信噪比S/N=实验组细胞侵袭的相对荧光值/对照组细胞侵袭的相对荧光值
自动化操作注意事项
1 BD Falcon FluoroBlok 24孔板培养小室系统能适用于自动化操作系统。盖子可以用标准机械手取走，也可用吸力取走。
2 为了避免各孔间污染，孔板设定为一个统一的方向。为了与培养小室匹配，确保Falcon的商标均在2者上方，面向同一个方向。
3 任何规格的枪头都能达到小室的两边。包括50μL，100μL，200μL，250μL，1000μL。