猕猴毛发皮质醇测量方法探索
时间：2020-07-23 阅读：960
测量时样品一般使用血清或者血浆，但是这种样品对研究应激的实验来说却存在许多问题，例如：取样过程中的捕捉、麻醉、取样前是否进食、取样前短时间内环境变化引起的躁动及皮质醇的昼夜节律变化都会对动物的应激实验造成干扰。
在动作敏捷、个体较大的群养动物应激研究中，问题更为突出：如多次采血带来的动物福利问题；由于不能在短时间内捕捉到动物，捕捉时目标动物和同笼的其他动物所受到的应激影响；多次重复捕捉给动物带来的影响。这些问题都可能会影响应激相关研究实验数据的可信性，阻碍了个体较大的群养动物（如猕猴——一种非常好的人类疾病研究模型）的应激研究。因此，取样技术的选择在应激研究中显得尤其重要。
为了避免这些问题，毛发样品是一种很好的选择，血液里的物质可以通过毛细血管渗透到毛囊细胞，后扩散到毛发里。因此，从毛发中可以提取出皮质醇。
1、毛发提取过程
样品粉碎是提取毛发皮质醇非常关键的一步，从相关文献中可以发现Davenport等对这一步骤的改进：起初为剪碎，后来使用了德国莱驰MM200 进行研磨粉碎。我们使用了德国莱驰MM400，并在文献基础上做了一定改进：将样品放入液氮内充分冷冻变脆后，再进行研磨，这样既可以使研磨粉末更细、更均匀，又可以避免研磨过程中局部高温对样品造成的影响。
终用甲醇进行提取。
具体操作步骤：
（1）称取 500 mg毛发样品置于 15 mL玻璃试管中，加入10 mL异丙醇。在室温下将该试管放于调速多用振荡器上洗涤 3 min（频率 100 次/min），共洗涤 2 次；洗涤后的样品置于电热恒温干燥箱内，37℃干燥 8 h。
（2）干燥后将样品放入 80 mL小烧杯内，用手术剪剪碎。之后放入 25 mL不锈钢研磨罐内（内有 15 mm不锈钢研磨球一个），拧紧后将罐放入液氮内冷冻至液氮停止沸腾。将研磨罐装入冷冻混合型球磨仪MM400，研磨 2.5 min（频率 26 Hz）。
（3）称取400 mg毛发粉末a，置于 10 mL离心管内，并加入 8 mL甲醇。室温下，将离心管置于振荡器，振荡 24 h（频率 230 次/min），提取皮质醇。
（4）将离心管离心 5 min（离心力 12 000 g,），取 4 mL上清液移入 5 mL离心管内。
（5）在 5 mL离心管内取 2 mL上清液放入2 mL离心管，室温用氮气流进行干燥，样品干燥后，加入 5 mL离心管内的剩余样品，继续干燥（随着甲醇的挥发，离心管内出现悬浮物。我们对这些悬浮物进行了研究）。
（6）干燥后加入 0.5 mL PBS (磷酸缓冲液：NaCl 8 g, KCl 0.2 g, Na2 HPO4 1.44 g, KH2 PO4 0.24 g，加去离子水定容至 1 L，将pH值调整到7.4)对样品进行重构。振荡混匀后，放入−20℃冰箱内储存至检测日。
2、实验设计
(1)为排除离心管和 PBS (磷酸缓冲液)带来的假阳性，我们将 0.5 mLPBS 放入离心管进行了放免检测(n=3)。
(2)离心管壁可能会吸附皮质醇，对皮质醇浓度测量造成影响，为检测这种影响，我们将重构后的样品的 1/2 移入新管，如果有吸附作用，则新管(n=10)中样品由于经过了两次吸附，皮质醇浓度应低于原管(n=10)。
(3)为了检验悬浮物对测量结果是否有影响，我们对同一样品的浊液(n=10)和清液(n=10)进行了比较。
(4)为了保证实验操作的可靠性，我们对其中一批样品(n=16)在不同时间进行了两次放免测量。对同一只动物(n=16)的两个样品，不同时间做了同样的处理。(5)为了证明毛发中的皮质醇可以反映动物受到的应激大小，我们对毛发中的皮质醇浓度与动物受到的攻击量(n=16)进行了相关分析。
3、实验结果
4、讨 论
整个提取过程中，离心管和 PBS 并没有对样品造成假阳性。这说明样品皮质醇来源于毛发，而不是污染。离心管壁没有吸附皮质醇，因此不会对数据的可靠性造成影响。重构后样品是一种浊液，难以分离，不过我们实验证明样品里的悬浮物对结果不会造成影响，不需要分离。然而，我们建议检测前将样品混匀。同一样品两次测量的结果，其高度相关性表明了放免检测操作过程稳定，重复性好，测量结果可信。同一动物两个样品间的高度相关性为我们整个实验操作的可靠性提供了证据，同时也说明同一动物邻近毛发的皮质醇含量高度相关。受到的攻击量虽然是血浆中皮质醇浓度的间接指标，但是它与毛发皮质醇浓度的中度相关性，以及我们实验数据与文献数据皮质醇含量范围的一致性(Davenport et al，2006)，都说明了我们确实提取到了毛发中的皮质醇，数据可信，同时毛发皮质醇可以作为衡量应激刺激大小的指标。由我们的经验及测量得到的样品皮质醇含量低值和试剂盒的灵敏度大致可以推算出：在猕猴毛发皮质醇提取实验中，为得到足够浓度，毛发样品量不宜低于 200 mg。
总结：毛发皮质醇浓度可以作为衡量慢性应激刺激大小的指标。
文中使用的研磨设备——
德国RETSCH(莱驰)冷冻混合球磨仪MM400
冷冻混合型球磨仪MM400是一台台式多功能仪器。它主要运用于小量样品的干磨、湿磨以及低温研磨。
它能在几秒钟内就可以达到混合、均化粉末和悬浮物的目的。此外，混合型球磨仪还特别适合用于生物细胞破壁以及DNA/RNA的收集。MM400以其*的性能和高超的灵活度而成为实验室的*的仪器。
