前言

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在当今这个科研节奏飞快的时代，想要把科学论点高调地发表在顶级期刊上往往需要运用多种技术采集“立体而丰满”的结果作为论据支持。以组织样本为例，要实现单细胞分析，我们很容易会想到流式细胞术（Flow cytometry）。在此基础上进行空间定位分析，免疫组化（Immunohistochemistry）的优势则非常明显。而说到蛋白组学分析，质谱分析法（Mass spectrometry）无疑是最“接地气”的手段。喜爱高效率的我们不禁会问：“有没有一个技术能综合单细胞、空间定位和蛋白组学分析的优点呢？” 这时，徕卡人会自豪地告诉你：“Cell DIVE^TM了解一下~” 接下来，让我们结合实际应用，看看Cell DIVE^TM在单细胞、空间定位和蛋白组学分析方面的优势。
 

小鼠肠道簇状细胞单细胞分析

通过成像手段实现单细胞分析的最大难点在于如何实现单一样本的多色标记。传统荧光免疫组化技术受到荧光染料光学特征的限制，难以完成一个样本内超过7种生物标志分子的成像任务。Cell DIVE^TM技术通过多轮染色的手段克服了该难题，可以在一个样本内实现多于60种生物标志物的成像检测。配合病理分析软件，可以轻松地完成每个细胞内各种生物标志分子的半定量分析。

下面这篇文章就是我们美国范德比尔特大学医学中心（Vanderbilt University Medical Center）的客户用Cell DIVE^TM完成的小鼠小肠簇状细胞（Tuft cells）14种生物标志物的成像和异质性分析^[1]。簇状细胞，也叫做多吞饮小管细胞 （Caveolated cells），是一种分布于胃肠道的罕见细胞类型，约占所有肠上皮细胞的0.4%，其顶端呈现密集的微丝结构，并在化学传感（Chemosensing）中发挥作用。

作者通过功能性蛋白检测不仅发现了小肠簇状细胞的数量、组成和功能受饮食和肠道菌群调控的规律，还发现了Hopx和p-EGFR高表达的两个新簇状细胞亚群，为肠道簇状细胞的进一步研究提供了基础框架。在本研究中，Cell DIVE^TM发挥了强大的单细胞分析能力，帮助作者完成簇状细胞的精确定位和功能性分子表达量分析（图2）。

图2 小鼠簇状细胞（Tuft cells）超多标成像-分析图 ^[1] 

（1A）细胞圈选分割示意图，（2A & B）细胞群体t-SNE分析及簇状细胞异质性分析，（3）簇状细胞功能性分子荧光成像图。

肿瘤-免疫细胞空间定位分析

分子空间定位信息的呈现是显微成像技术的传统优势，但难以对成像数据进行深度信息挖掘，导致图像往往只能作为文章结论的“助攻”型结果。作为一套整体解决方案，Cell DIVE^TM结合了当今定量病理分析行业的金标准——HALO软件（图3），使图像深层信息的呈现不再遥不可及。单细胞生物标志物定量、组织区域AI智能识别、细胞密度/浸润/距离分析等HALO最擅长的分析方式能轻松解码超多标图像的隐藏信息。

图3 HALO定量病理分析示意图

接下来，我们通过一篇由美国梅奥诊所（Mayo Clinic）的客户发表的恶性黑色素瘤微环境研究的文章来看看Cell DIVE^TM强大的空间定位分析能力^[2]。肿瘤微环境中肿瘤细胞和免疫细胞的相互作用关系对研究肿瘤免疫应答具有重要意义。

作者用Cell DIVE^TM技术对173例III期恶性黑色素瘤病人临床样本中21种生物标志分子进行成像（图4），进而通过分析多个免疫细胞亚群的浸润特征，找到决定异质性肿瘤微环境中淋巴细胞浸润的关键因素——高表达HLA-1的肿瘤细胞。在本研究中，Cell DIVE^TM展现了优秀的批量数据处理和空间定位分析能力，帮助作者完成不同HLA表达水平的肿瘤细胞与淋巴细胞的精准定位分析（图4-6A）。

图4 黑色素肿瘤微环境中免疫细胞空间定位分析图 ^[2] 

（1B）肿瘤病人淋巴结分区视野选择示意图，热图显示所选视野标记分子表达差异，（3A & B）肿瘤微环境中淋巴细胞浸润密度分析，（6A）免疫细胞空间定位分析。

结肠癌MAPK信号通路蛋白组学分析

技术研发初期，Cell DIVE^TM之所以选择多轮抗体标记路线的原因之一是为了突破单一样品中检测生物标志分子的数量限制。作为一种理论上没有标记上限的实验手段，多轮抗体标记法可以更好地满足后续蛋白组学分析在标志分子数量上的需求。

为了更高效地进行实验设计，Cell DIVE^TM研发团队在技术研发的同时，进行了抗体库的建立。目前，已经完成了350余种特异性抗体的Cell DIVE^TM技术兼容性测试。不仅如此，我们还根据多个领域内著名的生信数据库（如KEGG PATHWAY等）将抗体按照不同研究方向进行归类。用户可以在抗体库内根据自己感兴趣的研究方向查找关键蛋白，极大地提高了实验设计环节中抗体选择的效率（图5）。

图5 肿瘤研究Cell DIVE^TM已验证抗体数（部分）

Cell DIVE^TM研发时期的一篇文章向我们展现了上述的抗体资源库在肿瘤病理分型方面具有优势^[3]。为了优化结直肠癌病理分型系统，作者利用抗体资源中的一系列生物标志物对747例I至III期结直肠癌样本进行了Cell DIVE^TM单细胞空间蛋白组学分析。针对不同生理事件和关注的信号通路，作者选取了细胞应激、细胞外基质、调节蛋白和激酶等61种生物标志分子。

通过蛋白组学分析，作者发现mTORC1通路上游蛋白RPS6、4E-BP1和ERK1/2的磷酸化程度有望作为判断结直肠癌病人雷帕霉素耐药的关键指标（图6）。这里不得不表扬一下Cell DIVE^TM抗体测试团队，完成了大量的抗体验证工作，帮助Cell DIVE^TM用户在实验设计环节节约了不少抗体信息检索的时间。

图6 结直肠癌Cell DIVE^TM检测和蛋白组学分析 ^[3] 

结语

作为一套整体解决方案，Cell DIVE^TM涵盖了从实验设计到图像采集再到结果分析的全套标准化操作流程、优秀的成像设备和强大的数据解析系统，帮助用户轻松实现超多标（>10种标记分子）成像，解锁单细胞空间蛋白组学分析技能。

图7 Cell DIVE^TM 超多标组织成像分析整体解决方案

参考文献：

[1] Eliot McKinley, et al. Optimized multiplex immunofluorescence single-cell analysis reveals tuft cell heterogeneity. JCI Insight. 2017, 2(11): e93487

[2] Yan Yiyi, et al. Understanding heterogeneous tumor microenvironment in metastatic melanoma. PLoS ONE. 2019, 14(6): e0216485

[3] Gerdes MJ, et al. Highly multiplexed single-cell analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue. PNAS, 2013, 110(29): 11982–11987

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