ECL化学发光底物（超敏）

产品简介：

 ECL超敏发光液用于检测直接或间接标记辣根过氧化物酶HRP的抗体及其关联的抗原。

产品组份：

用途：用于HRP标记抗体的Western Blot和HRP标记探针的核酸杂交。

产品特点：

1、灵敏度高：可检测低皮克级的蛋白；

2、信号持续时间长：光信号持续时间长达5小时；

3、稳定试剂：工作液在24小时内保持稳定；

4、成像方法：适用于CCD或激光凝胶成像仪；

5、价格经济：针对稀释的抗体浓度条件进行了优化，节省抗体：

一抗：以1 µg/mL储存液稀释1:1,000至1:4,000倍

二抗：以1 µg/mL储存液稀释1:2,000至1:5,000倍

6、简单易用：可替代其它公司的ECL发光底物，操作步骤无需进行特别优化；

使用方法:

1、执行常规SDS-PAGE、转膜和Western Blot步骤。注意用HRP标记IgG或用一抗-链亲和素-生物/素-HRP夹法。

2、 Western Blot最后一次洗膜的同时新鲜配制发光工作液：分别取等体积的溶液A和B，放入干净容器中混合。建议立即使用工作液，室温放置数小时后仍可使用但灵敏度略有降低。

3、 用镊子取出膜，搭在滤纸上沥干洗液但勿使膜干燥。将膜浸入发光工作液（0.125mL发光工作液/cm2膜）中，与发光工作液充分接触。室温孵育3分钟，准备立即压片曝光。孵育时间过长不会增加灵敏度，有时还会导致曝光条带异常。发光过程的本质是酶促反应，使用过少的发光工作液不利反应进行，也会导致膜上条带曝光不均和明显降低灵敏度。为达节约目的可将膜剪小但勿降低发光液用量。

4、 用镊子夹起膜，搭在滤纸上沥干发光工作液。但勿洗去发光液。

5、 打开X光胶片暗盒，在暗盒内表面铺一张面积大于膜的保鲜膜。将Western Blot膜贴在保鲜膜上，将保鲜膜折起来包裹Western Blot膜，去除气泡和皱褶，可剪去边缘部多余的保鲜膜。用滤纸吸去多余的发光工作液。用胶带将覆盖Western Blot膜的保鲜膜固定在暗盒内，蛋白带面向上。

6、 暗房内压X光胶片，分别曝光不同的时间，如数秒到数分钟。显影冲洗。建议第一次曝光 60 秒，之后可调整曝光时间以达到最佳结果。化学发光反应在底物孵育后的前 5-30 min期间是强烈的。这一反应可以持续几个小时，但强度会随时间下降，如有底物孵育后较长时间后曝光，曝光时间可能需要延长以获得较强信号。          

注意事项：

（1）步骤1～5可在日光灯下操作；但发光液曝露于强光下时间过久灵敏度可能略有降低，移到暗房操作可避免之。

（2）长时间曝光或蛋白过量，将加深背景并使条带强弱变化失去线性关系。曝光不足则条带模糊。

（3）发光工作液孵育约3分钟后膜上的条带发光。强条带发光在暗房中肉眼可见，低丰度蛋白条带发光较弱甚至肉眼不可见但可使X光胶片曝光。肉眼不可见的荧光实际上可持续数小时并使X光胶片感光，因而弱带可曝光1-10小时。如果曝光后条带不佳，可用洗膜缓冲液洗膜，重新孵育二抗，然后重新用ECL发光和曝光。

（4）由于超敏发光液极其灵敏，建议按照推荐比例稀释抗体。抗体浓度过高将造成高背景或没有条带，导致失败。

（5）某些保鲜膜包裹印迹膜时可能会淬灭荧光，应选择高质量保鲜膜。

（6）使用肉眼可见的预染色蛋白Marker和荧光-放射自显影曝光标签可精确确定胶片上条带的位置和大小。

（7）叠氮钠是 HRP 的抑制物，不要使用叠氮钠作为缓冲液的防腐剂。

问题解答：

*为检测系统活性，在暗室中，在一个清洁试管中制备1-2ml工作液。关闭灯，添加1ul未稀释的HRP标记二抗工作液。该溶液应当立即发出蓝色光，蓝光信号在随后的几分钟渐淡。

AMEKO试剂：超敏ECL化学发光底物

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