提取培养细胞
一, (动物实验室)先用酒精冲洗灌流系统,然后用蒸馏水再次冲洗(流速可稍快)
二,(细胞实验室)制作凝胶培养皿(为了有助于细胞贴壁),0.1%gelation 移液器 2ml/皿,轻轻摇晃,让relation充分铺在培养皿底部,然后放入37℃,5%CO2的恒温箱中1小时.
1.细胞操作台是无菌区域,操作前要用酒精洗手,需要放入操作台里的药剂也要用酒精消毒,尤其是瓶口.
2.添加gelation顺序为移液器吸取2mlgelation→打开培养皿盖子→注入gelation→盖上盖子→轻摇
三,制作肝脏冲洗液和肝细胞分离液
抽取SolutionⅠ40ml加入刻度试管中(两个 40ml/试管)
抽取SolutionⅡ30ml加入刻度试管中(两个 30ml/试管);抽取SolutionⅡ70ml加入刻度试管中(两个 70ml/试管)
将SolutionⅡ30ml的两个试管加入恒温箱中预热
分别称量12mg和5.4mg各两份collagenase ,称量蛋白酶12mg(使用敏感度高的测量器)
四,取小鼠,麻醉0.3ml试剂/只,观察小鼠呼吸转为浅快说明麻醉成功.剪取两条长约250px丝线,置于净水中备用
将SolutionⅠ40ml溶液与灌流器相连,用剪刀剪开小鼠腹部毛皮,然后用手充分撕开毛皮,尽量暴露胸腹部,用剪刀剪开小鼠腹部肌肉,露出肝脏和肝静脉,将之前备好的细线给小鼠肝静脉打一个松散的活结备用,打开灌流器,将流量调低,用针管穿刺肝静脉并固定,顺手剪开小鼠股动脉(右侧),观察肝脏有限红色逐渐变白然后呈浅黄色,且股动脉有液体流出,说明穿刺成功,调高灌流速度, SolutionⅠ40ml溶液灌流结束后,灌流SolutionⅡ70ml+12mgcollagenase溶液.
1.灌注SolutionⅡ70ml+12mgcollagenase是为了细胞间质的胶原蛋白,让肝细胞松散,易于提取.灌注速度3-4ml/min
2.灌注SolutionⅡ70ml+12mgcollagenase成功后,小鼠肝脏会呈现类似与乳糜状,用镊子轻触即破.
3.随着灌流液量增加,小鼠麻醉药也随之排除体外,此时小鼠会出现苏醒并抽搐.
五,灌流结束后,用剪刀摘取小鼠肝脏,放置于培养皿中(SolutionⅡ12mgcollagenase),在显微镜下去除胆囊和大血管,用镊子轻轻剥离肝细胞,并用剪刀将未*分离的肝组织剪碎.
5.4mgcollagenase+蛋白酶12mg+DNA酶0.06ml加入30ml SolutionⅡ溶液中混匀做成匀液,将剥离的肝细胞和组织倒入匀液中,置于37℃恒温液箱中轻微振荡消化处理30min.(加入DAN酶是因为DNA有粘着性，防止细胞聚集粘着)。
六，消化处理后的匀液中加入培养液终止消化反应，20g 5min离心分离（肝细胞较重离心后沉于试管底部，上清液大多是细胞外杂质），离心后去除上清液，然后用PBS（PH和渗透压与细胞大致相同）冲洗1-2次，在培养液中加入双抗，然后显微镜下细胞计数。
细胞计数的计数板上的四个正方形角落有很小的计数方格，细胞计数时分别计数那4个小方格，算出平均值X。细胞数=X*10/ml，每个培养皿中要加入5*10个细胞+1.5ml细胞培养液，显微镜下观察细胞悬浮于培养基中，然后放入37℃,5%CO2的恒温箱中培养。
七，LPS通常置于有菌的环境中，因此进行细胞培养前要先过滤。1000微克的LPS溶于10mlDMEM，过滤，然后加入30ml DMEM充分混匀。