蛋白电泳 SDS-PAGE及WESTERN BLOT
时间：2017-10-10 阅读：6150
蛋白电泳 SDS-PAGE原理
SDS是一种阴离子表面活性剂，能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。因此，各种蛋白质-SDS 复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响，而只是棒长的函数。这种电泳方法称为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称SDS—PAGE）。实验使用过程中，还加入DTT或者巯基乙醇，以打开蛋白间的二硫键，破坏蛋白质的四级结构。SDS—PAGE常采用垂直板不连续系统（分离胶与浓缩胶）。
一、样品制备
本公司有多种用于样品制备的组织裂解液，每款裂解液会配备一管蛋白酶抑制剂pmsf。本公司还有多种蛋白酶抑制剂供您使用。
- 实验试剂
- 蛋白提取
- 蛋白定量
| 产品货号 | 产品名称 |
|---|---|
| R0010 | RIPA_ |
| R0020 | 普通RIPA |
| R0030 | 非变性组织细胞裂解液 |
| A8260 | Aprotinin 蛋白酶抑制剂（抑肽酶） |
| P8100 | Pepstatin A 胃蛋白酶抑制剂 |
| P1260 | (All-in-one,100x)蛋白磷酸酶抑制剂混合物 |
| T8031 | Trypsin inhibitor 胰蛋白酶抑制剂 |
| P1260 | (All-in-one,100x)蛋白磷酸酶抑制剂混合物 |
| 539133 | Protease Inhibitor Cocktail Set VI |
| 539134 | Protease Inhibitor Cocktail Set III |
| PC0030 | Lowry法蛋白浓度测定试剂盒 |
| PC0010 | Bradford蛋白浓度测定试剂盒> |
| PC0020 | BCA蛋白浓度测定试剂盒 |
二、蛋白电泳
- 实验试剂
- 预制胶
- 制胶
- 上样及电泳
- 染色
SDS-PAGE如今已形成成熟的方案，实验室可根据自己的情况和习惯来选择试剂。如选择1、2、3、4、5、6、7、8、9全部试剂可自己配制。也可以选择配制好的试剂。如10、11、12、13/14、16、9、20。还可选择10、13/14、16、9、17、18、19、20。
| 系号 | 产品货号 | 产品名称 | 系号 | 产品货号 | 产品名称 |
|---|---|---|---|---|---|
| 1 | T8060 | TRIS 三羟甲基氨基甲烷 | 11 | S1051 | 4XSDS-PAGE分离胶缓冲液（PH=8.8） |
| 2 | G8200 | Glycine 甘氨酸 | 12 | S1052 | 4XSDS-PAGE浓缩胶缓冲液（PH=6.8） |
| 3 | S8010 | SDS 十二烷基硫酸钠 | 13 | P1016 | 4×蛋白上样缓冲液(含β-巯基乙醇) |
| 4 | A8080 | Acrylamide 丙烯酰胺 | 14 | P1015 | 4×蛋白上样缓冲液(含DTT) |
| 5 | M8200 | N,N-Methylene Bisacrylamide甲叉双丙烯酰胺 | 15 | D1070 | 1M DTT |
| 6 | A8090 | Ammonium Persulfate 过硫酸胺 | 16 | A1030 | 10%过硫酸氨 |
| 7 | D8220 | DTT 二硫苏糖醇 | 17 | T1020 | 1M Tris-HCL (PH6.8) |
| 8 | M8210 | β-Mercaptoethanol β-巯基乙醇 | 18 | T1010 | 1.5M Tris-HCL(PH8.8) |
| 9 | T8090 | TEMED 四甲基乙二胺 | 19 | S1010 | 10%SDS |
| 10 | A1010 | 30%丙烯酰胺（29:1） | 20 | T1070 | 5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液 |
三、WESTERN BLOT
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分，此技术称为免疫印迹（Western blot）。Western blotting检测系统除需要过氧化物酶标记的各种二抗外，还需要配套的显色试剂。索莱宝提供DAB显色和ECL化学发光两种试剂及相应试剂盒。
- 转膜
- 显色
Millipore和PALL公司的尼龙膜和pvdf膜，具有0.22um和0.45um两种规格。 转膜后还可以用P0012（10×丽春红）检测转膜效果，尤其是针对NC膜效果更佳。 为了节省成本和时间，您可以选择本公司的SW3020（Western Blot膜再生液）对用过的膜进行清洗，随后，可以使用不同的抗体进行下一轮Western Blot实验。 膜再生液实质是在不影响膜上结合的抗原的条件下将抗体洗脱下来，实际操作中，膜类型、抗体类型、浓度及抗原特性都影响洗脱难易度。 注意：适用于 ECL和类似的化学发光试剂进行的 Western 检测。不适用于非化学发光试剂进行的 Western检测，例如DAB，NBT/BCIP。
| 产品货号 | 产品名称 |
|---|---|
| P0012 | 10×丽春红 |
| SW3010 | 膜封闭液 |
| A1800 | 抗体稀释液 |
| A1810 | 一抗稀释液 |
| A1820 | HRP标记抗体稀释液 |
| A1830 | AP标记抗体稀释液 |
| A1840 | 荧光抗体稀释液 |
| T1085 | 1×TBST |
实验操作过程中您可以针对不同的抗体选择上面合适的稀释液。