Western Blot实验中滤纸和膜的选择 应用 用法
时间：2012-02-01 阅读：20061
Western Blot实验中滤纸及膜的选择
Western Blot实验中滤纸及膜的选择
Western Blot实验中滤纸使用的滤纸必须是 WHATMAN 3MM层析滤纸WHATMAN 3MM滤纸
【详细说明】
1、NC膜、PVDF膜、尼龙膜怎样鉴别？
解答：尼龙膜是较理想的核酸固相支持物，有多种类型；*纤维素(NC)膜是目前应用广的一种固相支持物，价格便宜；PVDF膜介于二者之间。
就结合能力而言：尼龙膜结合DNA和RNA能力可达480－600μg/cm2，可结合短至10bp的核酸片段；*纤维素膜结合DNA和RNA能力可达80－100μg/cm2，对于200bp的核酸片段结合能力不强；PVDF膜结合DNA和RNA能力可达125－300μg/cm2。
就温度适应性而言：尼龙膜经烘烤或紫外线照射后，核酸中的部分嘧啶碱基可与膜上的正电荷结合；*纤维素膜依靠疏水性相互作用结合DNA，结合不牢固；PVDF膜结合牢固，耐高温，特别适合于蛋白印迹。
就韧性而言：尼龙膜较强；*纤维素膜较脆，易破碎；PVDF膜较强。
就重复性而言：尼龙膜可反复用于分子杂交，杂交后探针分子可经碱变性被洗脱下来；*纤维素膜不能重复使用；PVDF膜可以重复使用。
2、在做Western Blot时，PVDF膜用甲醇浸泡的目的？
解答：PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。
3、检测磷酸化的JNK 和非磷酸化的JNK可以在同一张膜上吗？
解答：可以。
4、转膜后经丽春红染色的条带，为什么大分子蛋白的一端(即点样的一侧)的转膜不是很好？
解答：这是正常的，大分子的蛋白转移的慢，延长转移时间和电流，大分子一端就会好的多，但是小分子的就有可能会变淡。
5、膜一般要如何处理？
解答：一般用甲醇泡泡就可以了。
6、上下槽缓冲液有何要求，怎样才能达到佳效果。
解答：无要求。
7、跑电泳的时候配的胶总是“缩”是什么原因呢？是有的成分不对吗？
解答：没什么问题，就是胶里的水分被蒸发了。过夜时拿保鲜膜包起来，在里面加点水保持湿度就可以了。如果过夜，胶里的水分被蒸发，采用保鲜膜包上也可以；也可能母液(30%聚丙酰胺)有问题，可以重新配制一份观察；能够替换的试剂，尽量换一下，选用好的试剂，避免找麻烦。脱色液中甲醇的含量太高也会造成胶缩。
8、膜、滤纸、胶大小有何讲究？
解答：如果是用的是半干转，顺序为：阴极－滤纸－胶－膜－滤纸。滤纸的长宽比胶的长宽小1－2mm，而膜的长宽分别比胶的长宽大1－2mm。禁忌：上下两层滤纸因为过大而相互接触，这样会短路，电流不会通过胶和滤纸。
9、蛋白质的分子量跨度很大，如要分离小21KD，中至66KD，大至170KD，可以一次做好吗？
解答：这么广的分布不好转移，一般建议：21kd和66kd可以一起转，12％SDS-PAGE，湿转36V，3－5hrs就可以了， 可以根据实验室的经验调节；170kd 用7%SDS－PAGE， 48V 10hrs－16hrs。
10、不能很好地将大分子量蛋白转移到膜上，转移效率低怎么样解决？
解答：可以考虑：转移缓冲液中加入20%甲醇(是指终浓度)(优化的转移缓冲液，可以参考《蛋白质技术手册》)，因为甲醇可降低蛋白质洗脱效率，但可增加蛋白质和NC膜的结合能力，甲醇可以防止凝胶变形，甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间；转移缓冲液加入终浓度0.1%SDS，也是为了增加转移效率；用的转移膜，或使用小孔径的NC膜(0.2微米)；使用戊二醛交联；低浓度胶，如低至6％。太大时还可以考虑用琼脂糖胶；提高转移电压／电流；增加转移时间。
11、如何选择合适的蛋白杂交膜？
解答：蛋白质印迹杂交是分子生物学实验中极为常用的一门技术。选择质量上层、合乎要求、方便适用的杂交膜是决定这项实验成败的重要环节。根据杂交方案、被转移生物大分子的特性以及分子大小等等因素，我们要量体裁衣，从杂交膜的材质、孔径和规格上都要做出合理的选择。
*纤维素膜：*纤维素膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物。在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与*纤维素膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起，虽然这其中的机制还不是十分清楚，但由于*纤维素膜的这个特性，而且易于封闭非特异性结合，从而得到了广泛的应用。在非离子型的去污剂作用下，结合的蛋白还可以被洗脱下来。根据被转移的蛋白分子量大小，要选择不同孔径的*纤维素膜。因为随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。但是膜孔径如果小于0.1μm，蛋白的转移就很难进行了。因此，我们通常用0.45μm和0.2μm两种规格的*纤维素膜。大于20kD的蛋白就可以用0.45μm的膜，小于20kD的蛋白就要用0.2μm的膜了，如果用0.45μm的膜就会发生“Blowthroμgh”的现象。从膜的质地上来看，重要的指标就是单位面积上能够结合的蛋白的量。*纤维素膜的结合能力主要与膜的*纤维素的纯度有关，市场上有些*纤维素膜通常会有大量的醋酸纤维素，因而降低了蛋白的结合量。S&S公司采用的是100%纯度的*纤维素，保证了大的蛋白结合量，可达80-150μg/cm2。由于100%的纯度，因而也大大减少了非特异性的结合，降低杂交背景，无需高严谨度的洗脱步骤。其次，膜的强度和韧性也是需要考虑的因素。常规的*纤维素膜比较脆，漂洗一两次就会破损，不能反复使用。
PVDF转移膜：PVDF是一种高强度、耐腐蚀的物质，通常是用来制造水管的。PVDF膜可以结合蛋白质，而且可以分离小片段的蛋白质，初是将它用于蛋白质的序列测定，因为*纤维素膜在Edman试剂中会降解，所以就寻找了PVDF作为替代品，虽然PVDF膜结合蛋白的效率没有*纤维素膜高，但由于它的稳定、耐腐蚀使它成为蛋白测序理想的用品，一直沿用至今。PVDF膜与*纤维素膜一样，可以进行各种染色和化学发光检测，也有很广的适用范围。这种PVDF膜，灵敏度、分辨率和蛋白亲和力在精细工艺下比常规的膜都要高，非常适合于低分子量蛋白的检测。但PVDF膜在使用之前必需用纯甲醇进行浸泡饱和1-5秒钟。
离子交换型转移膜：*纤维素和PVDF膜是靠疏水作用结合蛋白的，还有一类膜是根据离子交换的方式结合生物大分子的。由DEAE(二乙氨乙基)修饰的纤维素制成的DEAE阴离子交换膜同样可以 作为蛋白质印迹的固相支持物。DEAE可以有效的结合阴离子基团，包括那些高于其等电点的蛋白质。在pH10以下，DEAE基团都能带电荷，在低离子强度的转移液中结合蛋白分子。其适的pH环境为5-7。DEAE膜可以用于蛋白多糖、病毒、酶以及血红蛋白的研究。这种0.45μm孔径的DEAE膜，除了可以做Western Blotting外，还可以用于核酸结合研究。
还有一种离子交换型膜是羧甲基(CM)修饰的纤维素膜，它可以结合蛋白和多肽分子，以及其他的一些带正电荷的样品，适结合pH范围在4-7。结合的多肽分子可以从CM膜上洗脱下来，用于氨基酸系列分析或微测序。
杂交膜转印膜*纤维素膜NC膜与PVDF膜的区别
杂交膜转印膜*纤维素膜NC膜与PVDF膜的区别
1. *纤维素膜
*纤维素膜是蛋白印迹广泛使用的转移介质，对蛋白有很强的结合能力，而且适用于各种显色方法，包括同位素，化学发光(Luminol类)、常规显色、染色和荧光显色；背景低，信噪比高。NC膜的使用也很简便，比如不需要甲醛预处理，只要在无离子水面浸润排出膜内气泡，再在电泳缓冲液中平衡几分钟就可以了；比如NC膜很容易封闭，也不需要特别严谨的清洗条件。转移到NC膜上的蛋白在合适的条件下可以稳定保存很长时间，不过要注意的是纯的硝纤膜在比较脆，又容易卷，操作要小心，不适合用于需要多次重复清洗的用途--因为经不起多次“折磨”。选择硝纤膜时要注意的是选择合适的孔径，通常20KD以上的大分子蛋白用0.45um孔径的膜，小于20KD的话建议选择0.2um的，如果小于7KD的话好选择0.1um的膜。另外还要注意选择纯的NC膜--混有含醋酸纤维(CM)的NC膜结合力会有所降低。另外提醒一句：由于NC膜上结合的蛋白会因为一些去污剂而被代替，因此在封闭时好使用较温和的Tween20，而且浓度不要超过0.3%(据说0.05%效果好)。一般而言，NC膜越纯，其蛋白结合能力就越高，所以要增加WB的灵敏度和分辨率，提高所使用膜的纯度是个可以考虑的选择。如果NC膜搀杂一些醋化纤维素--这在前面已经提到，会影响蛋白质结合。Protran由于是纯NC膜，比较脆，机械耐受力欠佳，需要小心操作，如果担心自己“粗手粗脚”，那么就可以考虑一下Optitran或者Pall公司的以耐受力著称的BioTrace NT Nitrocellulose Transfer Membrane。卷膜肯定是实惠的选择，只不过要自己动手裁剪--切记，必须带手套操作。
*纤维素膜生产商：
*纤维素膜生产商：
GE WHATMAN BA83 BA85 价格 1950.00/卷 有现货
GE RPN303C
PALL 66485 常用的NC膜 30cm*3m/卷超低*：1250.00/卷现货
2. PVDF膜
与*纤维素膜相比，PVDF膜在蛋白质截留能力，机械强度和化学相容性上都更*的性能。市售*纤维素膜的典型结合量是80-100μg/cm2,而PVDF膜结合量是100-200μg/cm2(而结合强度PVDF比硝纤膜强6倍！)。但是PVDF膜大的优点不仅于此：更好的机械强度和化学耐受性使PVDF膜在各种染色应用和多重免疫检测中成为理想选择；而且单个凝胶的泳道复本可用于多种目的，特别是需要做N端蛋白测序，在相当“严酷”的清洗条件下，当尼龙或者硝纤膜已经降解的情况下PVDF膜依然保持本色，笑傲江湖。所以PVDF也是要做蛋白测序的*选择。但不适合荧光。PVDF膜特别注意的是需要100%甲醇预处理(不超过15秒)再用缓冲液平衡，才能用，而且适用过程中万一干了也要同样程序再处理(不过要真出现这种问题也是自己欠扁，谁要你不小心呢，转膜前处理也就罢了，转膜后再这样处理可能会影响后继的抗体识别呢)。PVDF膜同样分0.45um和0.2um的，后者孔径小，对小分子蛋白有较好的拦截吸附，背景可能会比前者稍高。
pvdf膜生产商：
pvdf膜生产商：
MILLIPORE * 常年 现货
IPVH00010 0.45um 1650.00/卷
ISEQ00010 0.22um 2050.00/卷
PALL 66543 2150.00/卷
卷膜经济实惠，裁剪剩下的边角料还可以用来做点杂交。再次强调的是，疏水PVDF膜在用前必须经过50%或以上体积比的甲醇或者乙醇溶液处理几分钟，待膜变成半透明后用纯水漂洗一下，转入电泳缓冲液平衡才能用
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