一：胶回收常见问题及
二：PCR产物回收试剂盒可能出现问题及解决方法
三：质粒抽提常见问题解答
四：基因组DNA抽提
五：RNA操作指南
六：Trizol疑难解答
七：PCR疑难解答
八：RT-PCR
九：RACE

 胶回收常见问题及对策

1. 没有回收到DNA片段
如在洗脱后，发现洗脱液中没有DNA 片段，请检查是否按瓶身标签，在洗涤液中加入了无水乙醇。
 

2. 提取率低
1） 融胶液为酸性缓冲液，如融胶后，其pH 值升高将影响提取得率。请加入0.1 倍体积的3M 乙酸钾（pH5.0）。
2） 长时间使用后没有更换的电泳缓冲液，其pH 值较高，将影响DNA 的吸附。请更换新的电泳缓冲液后，再进行电泳，然后切胶。
3） 回收片断大小影响回收效率（见下图）；
4） 在洗脱前，将洗脱液于30～60℃温浴，可提高提取效率适当延长洗脱时间可增加回收效率。
5） 正确估计胶大小，确保加入足够量的Binding Buffer；使胶*融解；
6） 提高Binding Buffer用量可提高小片断DNA回收效率.对于<100bp的DNA片断,可加入6倍体积的Binding Buffer；

3. 吸光度测量结果问题
吸光度测量的是未知样品与调零标准之间的相对吸光度，所以请用与洗脱液体相同的液体，对测量样品进行稀释和调零。

4.如何计算提取率
1） 由于回收前样品中，往往含有非目的DNA 片段、引物、dNTP 等，所以不能用测回收前后吸光度的的方法计算回收率。
2） 可将回收前后DNA 片段一起电泳，使用凝胶成像系统拍照后，用配套的软件进行电泳条带灰度对比。
3） 注意，电泳条件及拍摄条件将对灰度对比结果造成很大影响，请仔细操作，以减小误差。

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PCR产物回收试剂盒可能出现问题及解决方法

1. 无DNA

DNA Wash Buffer没有用无水乙醇稀释；

2. 低DNA产量

样品中加入的Binding Buffer的量太少；请按照使用说明加入足够量的Binding Buffer；若DNA片段长度小于200bp，可加入6倍体积的Binding Buffer；若DNA片段长度大于4kb，则加入3倍体积Binding Buffer后加入1倍体积的双蒸水。

3. OD值与琼脂糖凝胶中的DNA产量不相符

从柱子上洗脱下来的痕量杂质增加了A260的值；请按照标准步骤操作；另一方面,还取决于琼脂糖/EB电泳的质量.

4.  点样时样品漂出孔外

在洗涤完之后没有把柱上的乙醇*除去；甩干空柱,然后再进行下面的洗脱步骤.

质粒抽提常见问题解答

1. 没有DNA被洗脱出来

没有用乙醇稀释Wash Buffer，按前面指导的方法准备DNA Wash Buffer

2. DNA产量低

a. 细胞裂解率低

只使用含有氨苄青霉素的LB或YT培养基.使用基本方案时，不要使用超过5ml的高拷贝质粒培养物.

在加入Solution‖前细胞没有充分混匀，可漩渦振荡悬浮液使之充分混匀.加入Solution‖后，延长孵育时间可获得清晰的裂解液.如果Solution‖没有盖紧，可能需要重配.可按以下准备：0.2N NaOH，1%SDS.

b. 细菌培养物生长过度或不新鲜

不要于37℃培养超过16小时，分离质粒前长时间存放培养物是不利的.

c. 使用的是低拷贝数质粒

增加培养物的体积至10ml，或使用质粒小量提取试剂盒II，培养物体积为25ml.

3. 产量中有大分子量的DNA污染

加入Solution‖后过分混和细胞裂解液，加入Solution‖后不要猛烈振荡或搖匀，可轻轻颠倒离心管几次使充分混匀

4. 光密度与琼脂糖凝胶上的DNA不符

从柱子洗脱下來的痕量杂质使A260升高；确保按操作指南中的步骤7和8洗脱柱子；另外，还依赖于琼脂糖／溴化乙锭电泳测定

5. 琼脂糖凝胶上可见RNA帶

SolutionI没有加入RNase A

6. 在琼脂糖凝胶上点样时，质粒漂出点样孔

洗脱步骤后，乙醇没有*从柱子上去除；按标准操作步骤中*甩干spin-column。