甲醛洋菜胶体电泳
时间：2010-12-18 阅读：379
甲醛洋菜胶体电泳 （formaldehyde-agarose gel electrophoresis）甲醛是一种常用的RNA 变性剂。在进行甲醛洋菜胶体电泳分析时，必须先配制含有甲醛的洋菜胶体，RNA 也必须先以甲醛及formamide 进行变性处理，以确保其二度结构充分被打开。由于甲醛可能是一种致癌物质，配制胶体及进行电泳分析时都应在抽气橱里小心操作；进行电泳时所使用的缓冲液为MOPS （3-[N-morpholino] propanesulfonic acid）。此外，含有甲醛的洋菜胶体比较滑溜，容易破裂，在移动胶体时应特别留神。由于rRNA 占细胞RNA总量的80~85%，以ethidium bromide 染色后，呈现于胶体上的两个主要RNA色带应该分别是large 与small rRNAs （真核生物为28S 与18S，原核生物为23S 与16S）；散布于small rRNA 附近，呈淡淡smear 的就是mRNAs，这是因为mRNAs 存在量不多，而且长度不一的缘故。长度较短的5S rRNA 及tRNA 等则在胶体下方也以特定色带呈现。
仪器用具：65℃恒温水槽；微量离心机；Mupid II 迷你电泳槽及铸胶器；UV transilluminator；防护面罩；拍立得相机；抽气橱
药品试剂：
自菌体抽取的RNA （I-1, I-2, U-1, and U-2） 与胞外转录反应所制备的正意股及反意股RNA （#1, #2, #3, and #4）。
5×formaldehyde gel running buffer （0.1 M MOPS, pH 7.0; 40 mM sodium acetate; 5 mM EDTA）
Formaldehyde gel loading buffer （0.25% bromophenol blue; 0.25% xylene cyanol;50% glycerol; 1 mM EDTA）
Ethidium bromide （1 μg/μL in dH2O/DEPC）
dH2O/DEPC
方法步骤：
◆ 注意：
a. 下列实验主要参照Sambrook and Russell （2001） 的方法。
b. 进行下列实验时请务必戴手套。
c. 甲醛与formamide 都放在抽气橱内。
准备一片1.2%甲醛洋菜胶体：
1） 秤取0.48 g agarose置100 mL血清瓶，加入25 mL dH2O/DEPC。
2） 以微波爐加热溶解的后，微微晃动血清瓶使混合均匀，再移至60℃恒温水槽静置5 min。
3） 将装着agarose 溶液的血清瓶移至抽气橱，加入8 mL 的5× formaldehyde gel running buffer 及7.2 mL 的甲醛，轻轻摇晃血清瓶以便混合均匀。
胶体总体积为40 mL，为了避免agarose 溶液因温度快速下降，很快便凝固，应力求动作迅速，但应避免剧烈摇晃，以免弄出一大堆气泡，影响胶体凝结。
4） 尽速于抽气橱内把混合液倒入胶体铸模，并插入样本梳 （teeth comb）。胶体凝固至少需时30 min。
电泳：
1） 要进行电泳时，把已凝固的洋菜胶体放进电泳槽，并加入适量1×formadehyde gel running buffer。
2） 以50 V 定电压预跑5 min。
3） 依序注入上列8 个RNA 样本，以50 V 定电压进行电泳，待追踪染剂移动至胶体三分的二处时，关闭电源，将胶体移至UV transilluminator box，观察RNA 色带的存在情形，并拍照存证。
注意：这一片胶体往下将用來进行北方转印实验，请小心处置！