Random priming
时间：2010-12-18 阅读：969
DNA聚合酶要进行DNA聚合反应时一定要有引子 （primer），因为它只能以引子所提供的3’-OH为起始点进行延伸 （extension） 的工作，而不能就地重新合成新的DNA （de novo synthesis）。 一般实验常以人工合成的寡核苷酸为引子进行DNA聚合反应，这时固然可以根据已知序列设计核酸引子，但也可以采用逢机引子（random primers）。 所谓逢机引子即其序列为逢机序列，不经特别设计，目前应用zui广者是以自动化机器所合成的、六到八个核苷酸长的寡核苷酸混合物；反应进行中若有任何一条逢机引子结合到模版DNA，即可引导DNA聚合反应的进行。 以random priming方法进行核酸标定，是以逢机引子引导Klenow fragment（large fragment of E. coli DNA polymerase I） 进行DNA聚合反应，并在反应过程中添加 [α-32P]dNTP或DIG-11-dUTP等标定物质。 而为了避免random priming也发生于载体部份的DNA，不要直接以质体DNA为模版进行标定反应，而应预先将目标DNA自载体切除出來。
仪器用具：微量离心机；沸水浴及冰浴
药品试剂：
模版DNA （pBlueGus 的BamHI-HindIII DNA 片段，将由助教提供）
0.2 M EDTA, pH 8.0
4 M LiCl
Random priming kit （Roche）：
Hexanucleotide mix （random primer）
dNTP mixture （1 mM dATP, 1 mM dCTP, 1 mM dGTP, 0.65 mM dTTP, 0.35
mM DIG-11-dUTP, pH 7.5）
Klenow enzyme （2 U/μL）
酒精
70%酒精
TE （10 mM Tris-Cl, pH 8.0; 1 mM EDTA）
方法步骤：
◆ 以下反应条件与步骤主要参照random priming kit 制造厂商所提供的产品说明书。
1） 取100 ng 模版DNA，加入适量去离子水，把体积补足为15 μL。
2） 于沸水中加热10 min。
◆ 请记得以夹子固定微量离心管的管盖部份，以免离心管在加热过程中盖子爆开、进水！
3） 加热后，迅速把微量离心管移至冰浴中，静置数分钟。
4） 离心数秒后，依序加入下列三种试剂：
2 μL hexanucleotide mix
2 μL dNTP mixture
1 μL Klenow enzyme
5） 以指头轻弹离心管，以便混合均匀。
6） 短暂离心后，置于37℃恒温水槽中作用2 h。
◆ 反应时间至少须要1 h，zui长可反应过夜。
7） 作用完毕的后，加入2 μL 的0.2 M EDTA，以便终止DNA 聚合反应。
8） 加入2.5 μL 4 M LiCl及75 μL纯酒精，混合均匀，置 -20℃过夜。
隔天：
1） 于13,000 rpm，4℃离心15 min。
2） 倒出上清液，加入50 μL 的70%酒精，再离心5 min。
3） 倒出上清液并风干DNA。
4） zui后以50 μL TE 溶解DNA。