PCR参数设定的基本原则
时间：2010-12-23 阅读：2926
一个PCR反应开始，首先是双链DNA解离为单链，使之有利于与引物结合过程可以通过加热来完成。在90—95℃条件下，即使复杂的DNA分子，如人基因组DNA也可变性成单链，根据模板DNA复杂程度，可以调整变性温度和时间。一般情况下选择94‘C、30s可使各种复杂DNA分子*变性。过高温度或持续时间过长，对TaqDNA聚合酶活性和dNTP分子都会造成损害。
变性后的DNA很快冷却至40～60℃，即可使引物和模板DNA发生结合。这是由于模板DNA结构比引物复杂得多，引物和模板之间碰撞的机会大大高于模板互补链之间的碰撞。复性温度的选择，可以根据引物的长度和其G-+-C含量确定。引物长度为15～25bp时，退火温度可通过Tm＝4X（G+C）+2X（Ad-T）计算得到。在Tm允许的温度范围内，选择较高的退火温度可大大减少引物和模板之间的非特异结合，提高
PCR的特异性。退火时间设置为30s，足以使引物和模板之间*结合。
PCR反应的延伸温度为70—75℃，此时，TaqDNA聚合酶具有zui高活性。引物在16个核苷酸以下时，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。可采用反应温度缓慢升高到70～75℃的方法。因为在zui初较低温度下，DNA聚合酶已催化延伸反应开始，随后的较高温度不会对“延长”过的引物和DNA模板的结合发生影响。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定。一般lkb以内的片段，延伸时间lmin足够。扩增片段在lkb以上则需增加延伸时间。
以上参数确定后，PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。理论上20～25次循环后，PCR产物的积累即可达到zui大值。实际操作中由于每步反应的产率不可能达到*，因此不管模板浓度多少，20～30次是比较合理的循环次数。循环反应的次数越多，非特异性产物的量也会增加。