[器材和试剂]

● XL1-B1ue或者DHF’TB细胞

● f1R1噬菌体

● TB

● TBS（tris缓冲盐水；50mmol/LTris- HCL pH 7．6 ,150mmol/L NaCl，0．05％硫柳汞）

● PEG/NaCl溶液（20％PEG，2，5mol/L NaCl）

● 皮氏培养皿，直径150mm（Falcon）

● UV Stratalinker 2400（Stratagene）

● 硫柳汞（Sigma）

 

[方法]

1．用来自备存材料的或直接取自一个噬菌斑的f1Rl噬菌体，其浓度大约为10⁹个噬菌斑形成单位（pfu）， 感染2ml XLl-B1ue（Stratagene） 或者DH5。F’TB细胞。37℃静止孵育15分钟，再搅动2～3小时。

2．在一个2L烧瓶中，将感染混合物稀释到含有20ug/ml四环素的800mlTB液中。37℃孵育12-14小时，剧烈摇动（至少150r/min）。

3．用1000m1塑料瓶离心细菌/噬菌体悬液，10℃下4700r/min 60分钟。

4．加入PEG 8000（终浓度4％）和NaCl（终浓度0．5mol/L）沉淀噬菌体。*溶解后，冰上放置4小时或4℃放置过夜。

5．4700r/min离心60分钟。小心除去上清。以原体积1/10的TBS溶解沉淀。

6．在上清中加入1/4体积的PEG/NaCl溶液，再次沉淀噬菌体，4℃冰上孵育2小时。

7．4℃10000r/min离心噬菌体30分钟，再用10mlTBS重悬噬菌体沉淀。

8．以8000r/min再次离心噬菌体15分钟，然后去除不溶性部分，以pfu为单位滴定噬菌体。

9．用TBS稀释已纯化的噬菌体至大约每毫升10¹³个。在269nm处读取吸光值（A₂₆₉）以测量每毫升颗粒数：颗粒数/m1＝A₂₆₉×稀释因子× 6×10¹⁶/6407。

10．将每种稀释比例的噬菌体溶液在各培养皿（直径150mm） 中滴加20～25ul。可用自动分液器（比如Eppendorf 4780）操作，以节省时间并避免吸嘴污染。

11．用Stratalinker在200.000uj下，进行2～3个照射循环。

12．收集已照射的噬菌体，加入0．05％硫柳汞，并按1m1体积分装，4℃保存。

13．通过测量pfu检查存活的噬菌体。噬菌体滴度应当低于每毫升10³个。