规格:20T/50T/100T，价格：400/700/1200元，产品简介

Annexin是一类广泛分布于真核细胞细胞浆内钙离子依赖的磷酯结合蛋白，参与细胞内的信号转导。Annexin V可选择性结合磷***氨酸(phosphatidylserine，简称PS)。磷酯酰***酸主要分布在细胞膜内侧，即与细胞浆相邻的一侧。在细胞发生凋亡的早期，不同类型的细胞都会把磷**氨酸外翻到细胞表面，即细胞膜外侧。磷酯***酸暴露到细胞表面后会促进凝血和炎症反应。而Annexin V和外翻到细胞表面的磷酯**结合后可以阻断磷酯**酸的促凝血和促炎症反应活性。因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。用带有绿色荧光的荧光探针EGFP标记的Annexin V，即Annexin V-EGFP，就可以用流式细胞仪或荧光显微镜非常简单而直接地检测到磷酯**氨酸的外翻这一细胞凋亡的重要特征。与FITC的绿色荧光信号相比，EGFP的绿色荧光信号具有信号强，不易淬灭，稳定性高等优点。Annexin V-EGFP细胞凋亡检测试剂盒(Annexin V-EGFP Apoptosis Detection Kit)是用EGFP标记的重组人Annexin V来检测细胞凋亡时出现在细胞膜表面的磷酯**氨酸的一种细胞凋亡检测试剂盒。可以使用流式细胞仪、荧光显微镜或其它荧光检测设备进行检测。本试剂盒还提供了碘化丙啶染色液，碘化丙啶可以染色坏死细胞或凋亡晚期丧失细胞膜完整性的细胞，呈现红色荧光。对于坏死细胞，由于细胞膜的完整性已经丧失，Annexin V-EGFP可以进入到细胞浆内，与位于细胞膜内侧的磷酯**酸结合，从而也使坏死细胞呈现绿色荧光。因此将Annexin V与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。

试剂盒组份

试剂盒组份 20 assays  50 assays 100 assays储存条件

Annexin V-EGFP 100μL 250μL 500μL 4℃避光

结合液 15 mL 40 mL 75mL 4℃

碘化丙啶 （PI） 100μL 250μL 500μL 4℃避光

试剂盒以外自备仪器和试剂

流式细胞仪或荧光显微镜、低速离心机、移液器,1.5m L离心管、载玻片、盖玻片、PBS、不含EDTA的***

操作步骤

1、对于悬浮细胞：A、在进行完细胞凋亡刺激后，1000g (约1000-2000rpm) 离心5分钟，弃上清，收集细胞，用PBS轻轻重悬细胞并计数。（注意：PBS重悬不能省略，PBS重悬的过程同时也起到了洗涤细胞的作用，可以保证后续Annexin V-EGFP的结合。）B、取1~5×105重悬的细胞，1000g离心5分钟，弃上清，注意要把PBS吸干净，（选做步骤：加入250ul的结合液轻轻重悬细胞，1000g离心5分钟，弃上清）加入500µl 结合液轻轻重悬细胞。C、加入5µl Annexin V-EGFP，轻轻混匀；再加入5 μL 碘化丙啶，轻轻混匀。D、室温(20-25℃)避光孵育10分钟。可以使用铝箔进行避光。E、随即进行流式细胞仪检测，Annexin V-EGFP为绿色荧光，PI为红色荧光。如果用于荧光显微镜下检测，滴一滴上述染色后的细胞悬液于载玻片上，并用盖玻片盖上细胞即可检测。2、对于贴壁细胞：A、把细胞培养液吸出至一合适离心管内，PBS洗涤贴壁细胞一次，用***(最好不用含有EDTA)消化细胞。（注：**消化时间不易过长，否则容易引起假阳性）B、细胞消化下来后，加入步骤2A中收集的细胞培养液，稍混匀，转移到离心管内，1000g离心5分钟，弃上清，收集细胞，用PBS轻轻重悬细胞并计数。C、取1~5×105重悬的细胞，1000g离心5分钟，弃上清，注意要把PBS吸干净，（选做步骤：加入250ul的结合液轻轻重悬细胞，1000g离心5分钟，弃上清）加入500µl结合液轻轻重悬细胞。D、加入5µl Annexin V-EGFP，轻轻混匀；再加入5 μL 碘化丙啶，轻轻混匀。E、室温(20-25℃)避光孵育10分钟。可以使用铝箔进行避光。F、随即进行流式细胞仪检测，Annexin V-EGFP为绿色荧光，PI为红色荧光。如果用于荧光显微镜下检测，滴一滴上述染色后的细胞悬液于载玻片上，并用盖玻片盖上细胞即可检测。3、对于贴壁细胞的原位荧光显微镜检测：注：本方法的优点是可以原位观察细胞凋亡，缺点是部分凋亡由于不贴壁而检测不到。A、(选做)如果条件许可，把细胞培养于24孔板、48孔板或96孔板内；或将细胞于盖玻片上生长，用适当的凋亡诱导剂诱导细胞凋亡，并设立阴性对照组。B、吸除细胞培养液，加入PBS洗涤两次；或将盖玻片用PBS洗涤两次。（选做步骤：用250ul的结合液洗涤盖玻片一遍）C、在500μL 的结合液中加入5μL Annexin V-EGFP， 5 μL碘化丙啶，轻轻混匀。D、将上述溶液滴加于培养板孔中，或滴加于盖玻片表面，使长有细胞的盖玻片表面均匀覆盖。E、室温(20-25℃)避光孵育10分钟; 随即在荧光显微镜下观察，Annexin V-EGFP为绿色荧光，PI为红色荧光。

保存条件

4℃保存，Annexin V-EGFP和碘化丙啶染色液需避光保存，一年有效。为长期保存，可以把Annexin V-EGFP和碘化丙啶染色液适当分装后-20℃保存，Annexin V-EGFP结合液可以直接-20℃保存。

注意事项

1、如果有细菌或真菌污染，会严重影响检测效果。2、染色后宜尽快检测，时间过长可能会导致凋亡或坏死细胞的数量增加。同时荧光物质均易发生淬灭，在进行荧光观察时，尽量缩短观察时间，同时在操作和存放过程中也尽量注意避光保存。3、如果检测时Annexin V-EGFP的荧光比较弱，建议用250ul的结合液轻轻重悬洗涤细胞，去除残余的磷酸盐溶液，同时也可缩小结合液的体积（比如200ul的体积）来提高Annexin V-EGFP的工作浓度。4、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。5、本试剂盒适用于检测活细胞，流式细胞仪检测时，细胞数量不以应低于1×105，，不适用于检测组织样本。6、因检测细胞的类型、凋亡诱导剂种类、使用的检测仪器不同，因而流式检测的荧光补偿也不同，因此建议每次检测均需使用未经凋亡诱导处理的细胞作为对照，进行荧光补偿的调节。7、用流式细胞仪检测，激发波长Ex=488 nm; 发射波长Em=530 nm。Annexin V-EGFP的绿色荧光通过FITC通道（FL1）检测；PI红色荧光通过PI通道（FL2或FL3）检测，建议使用FL3。荧光补偿调节：使用未经凋亡诱导处理的正常细胞，作为对照进行荧光补偿调节去除光谱重叠和设定十字门的位置。