亲和层析填料 肝素-琼脂糖凝胶 H.P
货号 ：S9370
规格 ：25mL

产品 简介 ：
    苯甲脒类物质是丝氨酸蛋白酶的广谱抑制剂，所以将这类物质偶联到琼脂糖凝胶上，可以从各种来源的样品中一步纯化胰蛋白酶、凝血酶、尿激酶、激肽释放酶、前激肽释放酶等丝氨酸蛋白酶。
    苯甲脒琼脂糖凝胶由于应用新的活化方法所以流速高， 非特异吸附少， 而且填料粒度均匀，所以分离效果好，是纯化丝氨酸蛋白酶类适合的填料。

亲和填料 特征 ：

适用范围 : 
    一步从各种样品中纯化丝氨酸蛋白酶类物质。

应用实例: 
   实验名称：苯甲脒琼脂糖凝胶 FF分离尿激酶。

实验步骤：
   （1）苯甲脒琼脂糖凝胶 FF装柱，1.6×20m，柱床体积为10ml
   （2）用缓冲液1平衡2-5个床体积，流速为2ml/min
   （3）取尿激酶粗品200mg溶解在20ml的缓冲液1中，用0.45µm的滤膜过滤，上样，流速
为1ml/min
   （4）用缓冲液1再洗2-5个床体积，流速为2ml/min
   （5）后缓冲液2进行洗脱，流速为2ml/min，收集洗脱峰，用SDS-PAGE纯化后的效果。
   （6）用纯水洗5个柱床体积，然后分别用100mM，pH8.0Tris-HCl缓冲液含1M NaCl和100mM,pH4.0的醋酸缓冲液含1M NaCl交替洗涤3次，再用纯水洗3个柱床体积，然后再用20%的乙醇流洗3个柱床体积，流速为2ml/min，柱子置于+4~8℃环境中保存。
   （7）色谱图见图1，SDS-PAGE结果见图2。 缓冲液组成：
    缓冲液1：100mM pH7.4的PBS缓冲液；缓冲液2：100mM醋酸缓冲液，pH4.0。

也可以用这个填料特异去除各种融合蛋白酶切后的丝氨酸蛋白酶，例如凝血酶以及胰蛋
白酶类蛋白酶。例如去除凝血酶上样缓冲液为：50mM pH7.4的PBS缓冲液含0.15M NaCl,洗脱缓冲液为：50mM pH7.4的PBS缓冲液含1M NaCl。

SDS-PAGE流程：
   （1）BSA法测量样品蛋白浓度；
   （2）根据测定样品的蛋白浓度，算出5-10µg/孔所需的体积；
   （3）向1.5ml EP管中加入含5-10µg蛋白的样品溶液，若体积小于10µL，则加20mM PBS
pH7.4补足10µl；若体积大于10µl，则要加入1ml无水乙醇，－20℃下浓缩1h；
   （4）取浓缩样品10000rpm离心15min，除去上清，37℃烘箱10min去除残余的乙醇；
   （5）在样品加入20mM PBS pH7.4和2×loading buffer各10µl，100℃下10min。取出后用冷却30s，4000rpm离心1s；
   （6）点样，电泳。

应用的注意事项 ：
   1  色谱柱装填
   1、所有需要用到的材料的温度要与色谱操作的温度一样，液体好做脱气处理。
   2、在柱子下端加入蒸馏水，以除去柱子中的空气，关闭柱子出口，在柱内保留少量的
蒸馏水。
   3、将琼脂糖凝胶连续倒入柱子时，要用玻璃棒的紧靠柱子内壁引流，以减少气泡的产
生，让填料先自然沉降。
   4、柱压不超过0.3MPa，如果装柱系统中无法测柱压，则控制流速高于300cm/h，但是在
使用中一般只用大流速的75%。
   2  蛋白的结合
平衡缓冲液可以采用如下配方：100mM pH7.4的PBS缓冲液，0.1M NaCl，pH8.0。上样完
毕后，继续用平衡缓冲液洗柱子，直到基线平稳。
   3  蛋白的洗脱
  （1）洗脱可以采取特异性或者非特异性洗脱。
  （2）特异性洗脱可以用目标分子的竞争剂，对氨基苯甲脒的抑制剂。对非特异性洗脱
而言，可以选用以下几种方法：
   a 改变离子强度，通常加入1M的NaCl，必要的话可以采用阶段洗脱或线性梯度洗脱。
   b 改变pH，可采用阶段洗脱洗脱或线性梯度洗脱来达到目的。
   c 降低洗脱缓冲液的极性。如可以在洗脱缓冲液中加入10%的二氧六环等。
   d 使用变性剂。如在洗脱缓冲液中加入尿素、盐酸胍等。

再生、清洗: 
1  再生
   用纯水洗5个柱床体积，然后分别用100mM，pH8.0Tris-HCl缓冲液含1M NaCl和
100mM,pH4.0的醋酸缓冲液含1M NaCl交替洗涤3次，再用水洗3个柱床体积，然后再用20%的乙醇流洗3个柱床体积，流速为2ml/min，柱子置于+4~8℃环境中。
   如果在色谱操作过程中用到了变性剂或者去污剂，也可以用上述方法洗柱子。
2  清洗
   在应用中，柱子上结合的一些物质如变性蛋白和脂质等不能通过再生过程去除，这种
情况下，可以用去污剂如0.1%Triton X-100在37℃洗柱子1min。之后立即用5个床体积的平衡液洗柱子。

保存: 
    在20%乙醇中，4℃下长期保存。

特别注意 ：
    上样之前 ， 样品必须去除色素 ， 否则色素会被吸附到填料上 ， 影响填料的正常使用

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