亲和层析填料 苯甲脒-琼脂糖凝胶 6B
货号：S9390
规格 ：25ml /100ml

一、简介
    苯甲脒类物质是丝氨酸蛋白酶的广谱抑制剂，所以将这类物质偶联到琼脂糖凝胶6B上，可以从各种来源的样品中一步纯化胰蛋白酶、凝血酶、尿激酶、激肽释放酶、前激肽释放酶等丝氨酸蛋白酶。
   苯甲脒琼脂糖凝胶由于应用新的活化方法所以流速高，非特异吸附少，而且填料粒度均匀，所以分离效果好，是纯化丝氨酸蛋白酶类适合的填料。
二、亲和填料特性

三、  适用范围
    本一步从各种样品中纯化丝氨酸蛋白酶类物质。
四、应用实例
    实验名称：苯甲脒琼脂糖凝胶 FF 分离尿激酶。

实验步骤：
   （1）苯甲脒琼脂糖凝胶 FF 装柱，1.6×20m，柱床体积为 10ml
   （2）用缓冲液 1 平衡 2-5 个床体积，流速为 2ml/min
   （3）取尿激酶粗品 200mg 溶解在 20ml 的缓冲液 1 中，用 0.45μm 的滤膜过滤，上样，流速为 1ml/min
   （4）用缓冲液 1 再洗 2-5 个床体积，流速为 2ml/min
   （5）后缓冲液 2 进行洗脱，流速为 2ml/min，收集洗脱峰，用 SDS-PAGE 纯化后的效果。
   （6）用纯水洗 5 个柱床体积，然后分别用 100mM，pH8.0Tris-HCl 缓冲液含 1M NaCl 和 100mM,pH4.0的醋酸缓冲液含 1M NaCl 交替洗涤 3 次， 再用纯水洗 3 个柱床体积， 然后再用 20%的乙醇流洗 3 个柱床体积，流速为 2ml/min，柱子置于+4~8℃环境中保存。
   （7）色谱图见图 1，SDS-PAGE 结果见图 2。 缓冲液组成：

缓冲液 1：100mM pH7.4 的 PBS 缓冲液；缓冲液 2：100mM 醋酸缓冲液，pH4.0。
也可以用这个填料特异去除各种融合蛋白酶切后的丝氨酸蛋白酶，例如凝血酶以及胰蛋白酶类蛋白酶。
    例如去除凝血酶上样缓冲液为： 50mM pH7.4 的 PBS 缓冲液含 0.15M NaCl,洗脱缓冲液为： 50mM pH7.4 的 PBS缓冲液含 1M NaCl。

SDS-PAGE 流程：
   （1）BSA 法测量样品蛋白浓度；
   （2）根据测定样品的蛋白浓度，算出 5-10μg/孔所需的体积；
   （3）向 1.5ml EP 管中加入含 5-10μg 蛋白的样品溶液，若体积小于 10μL，则加 20mM PBS pH7.4 补足 10μl；若体积大于 10μl，则要加入 1ml 无水乙醇，－20℃下浓缩 1h；
   （4）取浓缩样品 10000rpm 离心 15min，除去上清，37℃烘箱 10min 去除残余的乙醇；
   （5） 在样品加入 20mM PBS pH7.4 和 2×loading buffer 各 10μl， 100℃下 10min。 取出后用冷却 30s， 4000rpm离心 1s；
   （6）点样，电泳。

五、注意事项：
5.1 色谱柱装填
   1、所有需要用到的材料的温度要与色谱操作的温度一样，液体好做脱气处理。
   2、在柱子下端加入蒸馏水，以除去柱子中的空气，关闭柱子出口，在柱内保留少量的蒸馏水。
   3、将琼脂糖凝胶连续倒入柱子时，要用玻璃棒的紧靠柱子内壁引流，以减少气泡的产生，让填料先自然沉降。
   4、柱压不超过 0.3MPa，如果装柱系统中无法测柱压，则控制流速高于 300cm/h，但是在使用中一般只用大流速的 75%。
   5.2 蛋白的结合
      平衡缓冲液可以采用如下配方：100mM pH7.4 的 PBS 缓冲液，0.1M NaCl，pH8.0。上样完毕后，继续用平衡缓冲液洗柱子，直到基线平稳。
   5.3 蛋白的洗脱
  （1）洗脱可以采取特异性或者非特异性洗脱。
  （2）特异性洗脱可以用目标分子的竞争剂，对氨基苯甲脒的抑制剂。对非特异性洗脱而言，可以选用以下几种方法：
      a 改变离子强度，通常加入 1M 的 NaCl，必要的话可以采用阶段洗脱或线性梯度洗脱。
      b 改变 pH，可采用阶段洗脱洗脱或线性梯度洗脱来达到目的。
      c 降低洗脱缓冲液的极性。如可以在洗脱缓冲液中加入 10%的二氧六环等。
      d 使用变性剂。如在洗脱缓冲液中加入尿素、盐酸胍等。

六、再生、清洗
6.1  再生
    用纯水洗5个柱床体积，然后分别用100mM，pH8.0Tris-HCl缓冲液含1M NaCl和100mM,pH4.0的醋酸缓冲液含
    1M NaCl交替洗涤3次，再用水洗3个柱床体积，然后再用20%的乙醇流洗3个柱床体积，流速为2ml/min，柱子置于+4~8℃环境中。
    如果在色谱操作过程中用到了变性剂或者去污剂，也可以用上述方法洗柱子。
6.2  清洗
在应用中，柱子上结合的一些物质如变性蛋白和脂质等不能通过再生过程去除，这种情况下，可以用去污剂如0.1%Triton X-100在37℃洗柱子1min。之后立即用5个床体积的平衡液洗柱子。
七、保存
在20%乙醇中，4℃下长期保存。

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