兔SP检测试剂盒

货号：SP0021

规格：3ml/6ml/18ml

    本试剂盒适合于一抗为小鼠/兔 IgG 的免疫组化实验 DAB 显色。

    SP 试剂盒是专为免疫组化和其他免疫检测而设计的，用以显示组织和细胞中抗原分布。链霉亲和素(StreptAvidin)是一种从链霉菌中提取的蛋白质，同亲和素一样，对生物素有的亲和力，亲和素是一个碱性蛋白质（PI=10），经改造后可以转变成中性蛋白质。链霉亲和素等电点接近中性，对组织和细胞的非特异吸附很低，因此基于链霉亲和素的免疫组化方法背景很低。

操作步骤:（以石蜡切片为例）
1. 切片常规脱蜡水(三次二甲苯，三次乙醇)。
2. 3% H2O2 室温处理 5-10 分钟以灭活内源性酶。蒸馏水洗 3 次。
3.可选步聚：
a、热修复抗原，将切片浸入 0.01M 柠檬酸钠缓冲液（PH6.0），电炉或微波炉加热沸腾后断电，间隔 5-10 分钟后，反复 1-2 次。冷却后 PBS（pH7.2-7.6）洗涤 1-2 次。
b、酶消化，滴加消化液，37℃10 分钟，PBS（pH7.2-7.4）洗涤 2-3 次。
c、跳过此步，直接进入下一步。
4. 滴加封闭液，室温 20 分钟。甩去多余液体，免洗。
5. 用稀释液将一抗按一定比例稀释（稀释后的一抗 4℃可保存一周），也可另行购买抗体稀释液。滴加稀释的一抗 37℃ 孵育 1 小时左右或 20℃ 2 小时左右，也可 4℃过夜。PBS（pH7.2-7.4）洗涤 3次，每次 2 分钟。（一抗的稀释度、孵育时间和温度与染色强度、背景有直接关系。一般来说，阳性染色强度不够时，可提高一抗浓度和延长孵育时间；背景过高时，可降低一抗浓度和缩短孵育时间。）
6． 根据用量，用稀释液将 Bio-羊抗小鼠/兔 IgG 浓缩液按 1:100 稀释成工作液(1ml 稀释液加入 10ulBio-羊抗小鼠/兔 IgG 浓缩液混匀，此工作液 4℃可保存一周)。滴加 Bio-羊抗小鼠/兔 IgG 工作液，20-37℃ 孵育 30 分钟。PBS（pH7.2-7.4）洗涤 3 次，每次 2 分钟。
7．根据使用量，用稀释液将链酶亲和素-POD 浓缩液按 1:100 稀释成工作液(1ml 稀释液加入 10ul链酶亲和素-POD 浓缩液混匀，此工作液 4℃可保存一周)。滴加链酶亲和素-POD 工作液，20-37℃，30 分钟。PBS （pH7.2-7.4）洗涤 4 次，每次 5 分钟。
8．DAB 显色：根据用量，用 PBS（pH7.2-7.4）配制，按 1ml PBS 加入 50ul 20×DAB 显色液 A，加入 50ul 20×DAB 显色液 B 。充分混匀后滴加到切片上。室温显色，镜下控制反应时间，一般在 5-30分钟之间。蒸馏水洗涤终止反应。
9．苏木素轻度复染。脱水，透明，封片。显微镜观察。对于细胞爬片，固定后，PBS 漂洗两次，再用 0.5% Triton X-100 室温孵育 20 分钟，PBS 漂洗两次，3% H2O2 处理 15 分钟；PBS 漂洗两次，接上述第 4 步。对于冰冻切片，固定后，PBS 漂洗两次，接上述第二步。
 

注意事项：
如果染色背景过高，在 SP 反应之后，DAB 显色之前，用加有 0.01—0.02% TWEEN-20 的 PBST（pH7.2-7.4）洗涤切片 4 次，PBS 洗 2 次，然后 DAB 显色。
 

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