人白细胞介素6（IL-6）ELISA试剂盒

注意事项：

1. 试剂盒应在有效期内使用，请不要使用过期的试剂。

2. 试剂盒未使用时应保存在2-8℃冰箱，已复溶但未用完的标准品，请丢弃。

3. 试剂盒使用前请在室温恢复 30 min，且充分混匀试剂盒里的各种成份及制备的样品。

4. 在试验中标准品和样本建议作复孔检测，且加入试剂的顺序应保持*。

5. 为避免交叉污染，请在试验中使用 1 次性试管，枪头，封板膜（※）及洁净塑料容器。.

6. 浓缩生物素化抗体和浓缩酶结合物的体积较少，在运输过程中微量液体会沾到管壁及瓶 盖上，使用前请离心处理（5-10 S 即可），使管壁上的液体集中在管底部，取用时，请用移液器小心吹 打几次。

7. 除了试剂盒中的浓缩洗涤液和终止液可以通用外，请不要使用其他来源试剂盒内含的 试剂代替本试剂盒中的某单个组分。

8. 为保证结果准确，每次检测均需做标准曲线。

安全提示： 试剂盒中的终止液为酸性溶液，操作人员在使用时请带上手套并注意防护；在操作过程中也要避免试 剂接触皮肤和眼睛，如果不慎接触，请用大量清水清洗；检测血液样本及其它体液样本时，请按国家生物 实验室安全防护有关管理规定执行。
 

试剂盒组成及储存：

自备实验器材（不提供，可代购）

1． 酶标仪（主波长450nm，参考波长 630nm）

2． 高精度移液器及一次性吸头：0.5-10,2-20,20-200,200-1000μl

3． 洗板机或洗瓶

4． 37℃孵育箱

5． 双蒸水，去离子水，量筒等 
 

人白细胞介素6（IL-6）ELISA试剂盒

样本收集及储存：

1. 细胞培养上清： 将细胞培养基移无菌离心管，在 4℃条件下 1000 ×g 离心 10 min,然后将上清等量分装于小 EP 管并 于-20℃下保存（24 小时内检测可放入

2-8℃储存），避免反复冻融。

2. 血清样本： 室温血液自然凝固 20 min 后，在 4℃条件下 1000×g 离心 10 min，然后将上清等量分装于小 EP 管并于-20℃下保存（24 小时内检测可放入 2-8℃储存），保存过程中如有沉淀，请再次离心，避免反复冻融。

3. 血浆样本： 将全血收集到含抗血凝剂的管中，根据标本的实际要求选择 EDTA，柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，混 合 20 min，在 4℃条件下 1000×g 离心 10 min，然后将上清等量分装于小 EP 管并于-20℃下保存（24 小时内检测可放入 2-8℃储存），避免反复冻融。

※注意：血清血浆样本避免使用溶血、高血脂样本，以免影响检测结果；如果样本中的靶标物检测浓度高 于标准品的值，请将样品做适当倍数稀释后检测，建议正式实验前做预实验以确定稀释倍数。
 

人白细胞介素6

试剂准备：

1. 试剂回温：先在实验前 30 min 将试剂盒，待测样本放置于室温下，浓缩洗涤液如出现结晶，请放入 37℃温浴直到结晶全部溶解。

2. 配制洗涤液：预先计算好稀释后的洗涤液使用体积，然后用双蒸水或去离子水将 20 倍浓缩洗涤液稀释 成 1 倍应用液，未用完的浓缩洗涤液放入 4℃冰箱保存。

3. 标准品梯度稀释：加入标准品/样本稀释液（SR1）1ml冻干标准品中，静置15分钟待其*溶解后轻 轻混匀(浓度为2000pg/ml)，然后在其余七管中各加入500mL标准品/样本稀释液（SR1），按照以下浓度 进行2倍稀释：1000、500、250、125、62.5、31.25、15.62 pg/ml进行稀释。500pg/ml为标准曲线点 浓度，标准品/样本稀释液（SR1）作为标准曲线的零点（0pg/ml）。复溶过的标准品原液（2000pg/ml） 未用完的应废弃或根据需要按照一次用量分装，并将其贮存在-20～-80℃冰箱，具体如下图。

4. 生物素化抗体工作液：预先计算好试验所需用量，用检测稀释液（SR2）将100倍抗体浓缩液稀释成1倍 应用工作液（稀释前充分混匀），请在30分钟内加入到反应孔中。

5. 酶结合物工作液：按每次试验所需用量配制，用酶结合物稀释液（SR3）将100倍浓缩酶结合物稀释成1 倍应用工作液（稀释前离心），请在30分钟内使用。

IL-6 Human ELISA Kit结果判断：

1.用酶标仪 450 nm波长测定 OD 值。选择双波长检测，参考波长为 630 nm。如不能进行双波长检测，请 用 450 nm 的 OD 测定值减去 630 nm 的 OD 测定值。

2.计算标准品、样品的平均OD 值：每个标准品和标本的 OD 值应减去零孔的 OD 值

3.以标准品浓度为横坐标，吸光度OD值为纵坐标，用软件绘制标准曲线，样品中TNF-α含量可通过对应OD 值由标准曲线换算出相应的浓度。

4.若标本 OD 值高于标准曲线上限，应做适当稀释后重新检测，计算浓度时再乘以稀释倍数.
 

参数表征：

1. 数据及标准曲线

2. 灵敏度： 低可检测人 TNF-α浓度达 8pg/ml， 20 个零标准品浓度 OD 的平均值加上两个标准差，计算相应的可检测浓度。
3. 特异性： 不与人 TNF-β，GM-CSF，s TNFRI，s TNF RII 反应，小鼠 TNF-α，s TNF RI
4. 重复性： 板内，板间变异系数<10%。
5. 回收率： 在选取的健康人血浆、细胞培养上清中加入 3 个不同浓度水平的人 TNF-α，计算回收率。

6. 线性稀释： 分别在选取的 4 份健康人血浆和细胞培养上清中加入高浓度人 TNF-α，在标准曲线动力学范围内进行稀 释，评估线性.

参考文献：

1. Hirano, T. et al. (1984) J. Immunol. 133:798.
2. Kikutani, H. et al. (1985) J. Immunol. 134:990.
3. Hirano, T. et al. (1986) Nature 324:73.
4. Haegeman, G. et al. (1986) Eur. J. Biochem. 159:625.
5. Van Snick, J. et al. (1988) Eur. J. Immunol. 18:193.
6. .Lotz, M. et al. (1988) J. Exp. Med. 167:1253.
7. Hirano, T. et al. (1990) Immunol. Today 11:443.
8. Hirano, T. et al. (1990) in Peptide Growth Factors and their Receptors I, Sporn, M.B.and A.B.Roberts eds., Springer-Verlag, New York, p. 663.
9. Kishimoto, T. et al. (1992) Science 258:5593.
10. Hirano, T. (1992) Clin. Immunol. Immunopathol. 62:S60.
 

常见问题及解决方法：

 参考文献：
《iTRAQ‐Based Proteomic Analysis Exploring the Influence of Hypoxia on the Proteome of Dental Pulp Stem Cells under 3D Culture》 作者:Lei Dou  Qifang Yan  Panpan Liang  Pengfei Zhou  Yan Zhang  Ping Ji 期刊:Proteomics 影响因子:3.106 PMID:29327447
《Some cardiac marker levels and cytokines in diabetic patients》 作者:Esmail S. Kakey and Shahen S. Hussen 期刊:International Conference on Pure and Applied Sciences 影响因子: PMID:
《Effect of blood purification on serum miR-126 and VEGF levels in the process of atherosclerosis in uremic patients under maintenance hemodialysis》 作者:Dong Zhao,Hong Shao 期刊:The Kaohsiung Journal of Medical Sciences 影响因子:1.291 PMID:30041762
《Release of mitochondrial DNA correlates with peak inflammatory cytokines in patients with acute myocardial infarction.》 作者:Chaoyi Qin, Jun Gu, Ruiqi Liu, Fei Xu , Hong Qian, Qian He, Wei Meng 期刊:Anatol J Cardiol 影响因子:1.112 PMID:27721319