本产品用于：分离狗肿瘤浸润组织白细胞

注：本试剂内容中各单品可根据货号单独购买，客户可根据实际使用情况自行选择购买。

产品名称：狗肿瘤浸润组织白细胞分离液试剂盒

（细胞培养及分子生物学）说明书

【产品组成】

为方便广大用户使用，试剂内容如下：

 名称 产品编号 规格

A 各种动物外周血白细胞分离液 详见附录 1 2×100ml

B 红细胞裂解液（赠品） NH4CL2009 100ml

C 全血及组织稀释液（赠品） 2010C1119 100ml

D 细胞洗涤液（赠品） 2010X1118 100ml

注：本试剂内容中各单品可根据货号单独购买，客户可根据实际使用情况自行选择购买。

【预期用途】

适用于从动物抗凝血液中分离白细胞，无菌条件下所分离的白细胞可用于分子生物学及

细胞培养等。本品仅供科研使用。

【检验原理】

本分离液为 FICOLL、羟乙一基淀粉 550 与泛影酸葡甲胺的混合液。抗凝血液可在分离液

中分层。离心时，在 FICOLL、羟乙一基淀粉的作用下红细胞与粒细胞聚集并迅速沉降；此时，

白细胞仍处于分离液上层及分离液层，红细胞污染可通过红细胞裂解液裂解红细胞去除。大

部分血小板可在细胞清洗低速离心过程中去除。

其他人及动物多种比重细胞分离液，因不同种属不同比重分离液的细胞离散系数及细胞

带电不同，用户在制定分离液时应提供所需分离液的比重、动物种属及被分离细胞的名称。

【*但不提供的仪器及耗材】

可提供 400g 离心力的水平转子离心机、15ml 玻璃离心管、吸管等。

【注意事项】

1. 使用前，本分离液需复温至 18-22℃。为获得*的实验结果，在取血后 2 小时内

进行实验，血液提取后存放时间越长细胞活性越低。

2. 实验过程中，如需稀释血液或洗涤细胞，不可使用含 Ca、Mg 离子的缓冲液及培养液，其

成分会导致血细胞凝集大大降低细胞得率及纯度。本公司生产的全血及组织稀释液和细胞洗

涤液不含 Ca、Mg 离子、低内毒素水平且含细胞和保护成分，推荐使用。

3. *抗凝剂选择：EDTA、枸橼酸、肝素，其他抗凝剂也可使用，但会影响细胞活性。应

注意在血液稀释过程中去除抗凝剂体积。

4. 当血液样本粘度过高或血液样本大于等于 3ml 时，*稀释方法：将血液于 18-22℃以

250g 离心 10 分钟，弃去血浆，补充添加全血及组织稀释液（产品编号：2010C1119），添

加量为所弃去血浆体积的 1.5-2 倍，混匀备用。注：不当的稀释方法会降低细胞得率及活性。

5. 实验操作时，不可使用含粉手套、不可使用内毒素含量过高的液体，手套中的粉末颗粒

及高内毒素会激活细胞从而降低细胞得率及活性。

6. 本实验不可使用高聚合材质（如聚苯乙烯）的塑料制品，其带有的静电作用将导致细胞

贴壁影响分离效果。

7. 吸取过多的白细胞层及分离液层会导致分离液交界处的粒细胞被吸出从而使混杂的粒细

胞数量增加。

8. 吸取过多的白细胞层上层溶液会导致血浆蛋白及血小板混杂。

9. 如需进行细胞计数，则需血液贮藏时间不得多于 10 小时，否则将导致细胞被激活，得率降低。

10. 为去除所混杂的血小板，可在分离液上层加上 4-20%蔗糖梯度等渗溶液进行二次离心。

11. 细胞纯度可在步骤 10 后使用瑞氏染色方法确定，细胞活性可用台盼蓝处理后观察。

12. 如所实验后细胞得率或活性过低，请天津灏洋以寻求帮助，具体

详见“【生产企业】”项目下内容。

【检验方法】

情况 A: 血液样本小于 3ml 时，实验方法如下：

1. 取一支 15ml 离心管，加入 3ml 分离液置于 18-22℃。

2. 将血液样本小心加于分离液之液面上。18-22℃，400g 离心 20 分钟。低温（如 4 度）离

心会降低细胞得率。

3. 离心后，用吸管小心吸出分离液上层（包含白细胞的细胞层）0.5cm 以上的上清液部分，

弃去。

4. 用吸管小心吸取分离液层、白细胞层及红细胞层置于另一新离心管内。

5. 在步骤 4 中所得离心管中加入 10ml 细胞洗涤液（产品编号：2010X1118）混匀。

6. 250g 离心 10 分钟。

7. 弃上清，沉淀使用红细胞裂解液（Cat#：NH4CL2009）裂解红细胞（裂解过程参见下述【红

细胞裂解液使用说明】）。

8. 裂解后再经三次洗涤去除红细胞内溶物和碎片后即为所需白细胞。

9.后以 0.5ml 后续试验所需相应液体重悬细胞。

情况 B: 血液样本大于等于 3ml 时，实验方法如下：

1. 首先按“【注意事项】第 4 条”所述方法稀释血液样本。

2. 取一支适当的离心管，加入分离液（加入量与稀释后的血液样本体积相等），置于

18-22℃。

3. 将经稀释处理的血液样本小心加于分离液之液面上。18-22℃，400g 离心 20 分钟。低温

（如 4 度）离心会降低细胞得率。注：加入血液样本后，样本及分离液总体积不得超过

离心管总体积的三分之二。

4. 剩余步骤同“情况 A”中步骤 3 至步骤

【红细胞裂解液使用说明】

本裂解液有别于市场上销售的其它红细胞裂解液，其配方经过本公司优化在裂解红细

胞的同时不损伤并在一定程度上保护淋巴细胞(lymphocyte)或其它有细胞核的细胞，所获

得的细胞可保持完好的生物活性和完整的细胞形态。另外，本裂解液中无DNA及RNA酶，配

合细胞分离液使用所提细胞可广泛用于细胞培养及分子生物学实验，请广大用户从优选择。

红细胞裂解液(Red Blood Cell Lysis Buffer)，也称ACK Lysis Buffer，是一种用于

从人或鼠等的血液或组织细胞样品中裂解并去除无细胞核红细胞的溶液。

本裂解液不适用于有细胞核红细胞的裂解，例如鸟或禽类的红细胞。本裂解液经过无菌

处理，处理过的血液或组织细胞样品可以用于后续的原代培养、细胞融合以及核酸或蛋白的

提取及各种常规的分析和检测。

使用说明：

A. 对于组织细胞样品：

a. 新鲜组织经过胶原酶或胰酶等消化处理，通过适当方法分散成细胞悬液，离心弃上清。

b. 加入3-5倍细胞体积的红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，裂解1-2分钟。例如细胞沉淀的体

积为1ml，则加入3-5ml的红细胞裂解液。本步骤在室温或4度操作均可。

c. 400-500g离心5分钟，弃红色上清。4℃离心效果更佳。

d. 如果发现红细胞裂解不*，可以重复上述步骤2和步骤3一次。通常极微量的红细胞不

会影响后续的一些检测。

e. 洗涤1-2次：加入适量PBS、HBSS、生理盐水或无血清培养液，重悬沉淀，400-500g离心

2-3分钟，弃上清。可再重复1次，共洗涤1-2次。洗涤液的用量通常应至少为细胞沉淀

体积的5倍。4℃离心效果更佳。

White Blood

Cell

f. 根据实验需要用适当溶液重悬细胞沉淀后即可进行计数等后续实验。

B. 对于组织细胞样品无需洗涤的快速操作步骤：

a. 新鲜组织经过胶原酶或胰酶等消化处理，通过适当方法分散成细胞悬液，离心弃上清。

b. 对于0.2ml细胞沉淀加入1ml红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，裂解1-2分钟。本步骤在室温

或4度操作均可。

c. 加入15-20ml PBS、HBSS、生理盐水或无血清培养液，混匀。

d. 400-500g离心5分钟，弃红色上清。4℃离心效果更佳。

e. 如果发现红细胞裂解不*，可以重复上述步骤2和步骤3一次。通常极微量的红细胞不

会影响后续的一些检测。

f. 根据实验需要用适当溶液重悬细胞沉淀后即可进行计数等后续实验。

注：对于常规步骤，多一步洗涤过程中的离心，但可以节省洗涤液的用量，并且洗涤效果也更好一些，同

时不需要大体积的离心管。快速步骤少了一次离心，但洗涤效果略差一些，同时需要大体积的离心管。

C. 对于血液样品：

a. 取新鲜抗凝血，400-500g离心5分钟，离心弃上清。

b. 加入6-10倍细胞体积的红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，裂解1-2分钟。例如细胞沉淀的体

积为1ml，则加入6-10ml的红细胞裂解液。本步骤在室温或4度操作均可。注意：对于鼠

的血液，裂解1-2分钟已经足够，对于人的外周血，宜延长裂解时间至4-5分钟，并且裂

解过程中宜适当偶尔摇动以促进红细胞裂解。

c. 400-500g离心5分钟，弃红色上清。4℃离心效果更佳。

d. 如果发现红细胞裂解不*，可以重复上述步骤2和步骤3一次。通常极微量的红细胞不

会影响后续的一些检测。

e. 洗涤1-2次：加入适量PBS、HBSS、生理盐水或无血清培养液，重悬沉淀，400-500g离心

2-3分钟，弃上清。可再重复1次，共洗涤1-2次。洗涤液的用量通常应至少为细胞沉淀

体积的5倍。4℃离心效果更佳。

f. 根据实验需要用适当溶液重悬细胞沉淀后即可进行计数等后续实验。

注：对于微量或少量的血液样品，可以在*步中不进行离心弃上清的操作，直接在第二步中加入10倍血

液体积的红细胞裂解液，并在室温或4℃裂解4-5分钟。对于鼠的血液，裂解4-5分钟已经足够，对于人的外

周血，宜延长裂解时间至10分钟，但通常不宜超过15分钟，并且裂解过程中宜适当偶尔摇动以促进红细胞裂解。后续步骤相同。

D. 对于血液样品无需洗涤的快速操作步骤：

a. 每1ml新鲜抗凝血中加入10ml红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，裂解4-5分钟。

温或4度操作均可。注意：对于鼠的血液，裂解4-5分钟已经足够，对于人的外周血，宜

延长裂解时间至10分钟，但通常不宜超过15分钟，并且裂解过程中宜适当偶尔摇动以促

进红细胞裂解。

b. 加入20-30ml PBS、HBSS、生理盐水或无血清培养液，混匀。

c. 400-500g离心5分钟，弃红色上清。4℃离心效果更佳。

d. 如果发现红细胞裂解不*，可以重复上述步骤2和步骤3一次。通常极微量的红细胞不会影响后续的一些检测。

e. 根据实验需要用适当溶液重悬细胞沉淀后即可进行计数等后续实验。

注：对于常规步骤，多一步洗涤过程的离心，但可以节省洗涤液的用量，并且洗涤效果也更好一些，同时

不需要大体积的离心管。快速步骤少了一次离心，但洗涤效果略差一些，同时需要大体积的离心管。

【储存条件及有效期】

18-25℃避光保存，有效期 2 年。启封后置 4℃保存，溶液变浑浊或感染细菌时，产品

失效。本品为真空包装，未启封前置于 10℃ 以下易出现白色结晶，影响分离效果。

【适用仪器】

半径 15cm 水平转子离心机。

【样本要求】

本分离液要求血液为新鲜的抗凝血，血液收集时应无菌操作且在储存、处理和运输过

程中避免冷冻和冷藏。

【参考值（参考范围）】

本实验白细胞的提取率及纯度均大于 80%。

【检验结果的解释】

由于各品牌离心机的性能不同，国内南北地区温度环境和四季的差异，可能影响分离效

果，用户可以调节离心转数和离心的时间，摸索*的分离条件（具体分离条件各实验室自

定）。

【检验方法的局限性】

本试验要求，在正常大气压下，样本、分离液及分离环境温度为 18-22℃。本分离液在

低温时呈较高密度，在高温时呈较低密度。

【产品性能指标】

pH 7.0-7.5

渗透压 280-340mOsmol/kg

无菌 直接接种培养 14 天后培养基澄清

澄明度及不溶性颗粒物 每 50ml 溶液中含 10μ m 以上的不溶性微粒 20 粒以下，含

μ m 以上的不溶性微粒 5 粒以下

【参考文献】

1 郑德先，吴克复，褚建新.现代实验血液学研究方法与技术.北京医科大学中国协和医科大

学联合出版社，1999

2 鄂征.组织培养.北京出版社，1995

3 朱立平，陈学清.免疫学常用实验方法.人民军医出版社，2000

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