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EF02103 2014-01 版
孔雀石绿快速检测试剂盒说明书
一、原理
孔雀石绿快速检测试剂盒采用间接竞争 ELISA 方法,在微孔条上预包被偶联抗原,样本中的残留物孔雀石绿将和 微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗孔雀石绿抗体, 加入酶标记物后,用 TMB 底物显色,样本吸光值 与其所含残留物孔雀石绿的含量成负相关,与标准曲线比较即可得出相应残留物孔雀石绿的含量。
二、试剂盒特性
试剂盒灵敏度: 0.05ppb
孵育温度: 25℃
孵育时间: 30min~30min~15min
样本检测限
水样 ———— 0.1ppb
水产品 ————0.5ppb
交叉反应率
显性孔雀石绿 —————— | 100% | |
隐性孔雀石绿 —————— | 0.1% | |
结 晶 紫 | —————— | 95% |
隐性结晶紫 | ———————— | 0.1% |
样本回收率
水样、水产品 ···························· 80%~110%
精密度
板内、板间变异系数≤12%
三、试剂盒组成
1 | 微量测试孔 | 每条 8 孔,一板 12 条 | |
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| 10 倍浓缩标准液 | 0ppb | 0.5ppb |
| ×6 瓶 |
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2 | 1.5ppb | 4.5ppb | |
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| (1ml/瓶、黑色帽) 13.5ppb | 40.5ppb | |
3 | 酶标记物 | 12ml | 红色帽 |
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4 | 抗体工作液 | 7ml | 蓝色帽 |
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5 | 底物 A 液 | 7ml | 白色帽 |
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6 | 底物 B 液 | 7ml | 黑色帽 |
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7 | 终止液 | 7ml | 黄色帽 |
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8 | 20X 浓缩洗涤液 | 40ml | 白色帽 |
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9 | 氧化剂 | 3ml | 黑色帽 |
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10 | 4X 浓缩复溶液 | 50ml | 透明帽 |
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四、所用仪器、试剂
具备的仪器:酶标仪、均质器、振荡器、离心机、 刻度移液管、天平(感量 0.01g)、氮 吹仪、恒温箱
微量移液器:单道 20~200µl、单道 100~1000µl、
多道 30~300 µl
试 剂:乙腈、二氯甲烷、无水硫酸钠、正己烷
五、样本前处理步骤
样本处理前须知
(a)实验中必须使用一次性吸头,吸取不同试 剂时要更换吸头。
(b)实验之前须检查各种实验器具是否干净, 必要时可对实验器具进行清洁,以避免污染干扰实 验结果。
样本前处理需配制: 配液 1 样品提取液乙腈-二氯甲烷混合溶液:
V 乙腈-V 二氯甲烷 = 4 : 1,取 40ml 乙腈, 再加入 10ml 二氯甲烷,混匀后使用。
配液 2 样品复溶液
将 4X 浓缩复溶液用去离子水按 1:3 稀释 (1 份 4×浓缩复溶液+3 份去离子水),或按所需用 量配制。
样本处理:
(a)水样处理方法
取 50µl 清澈水样样直接测定(如果水样浑浊 一定要过滤或 4000r/min 离心 10min,直至得到 清澈样),暂不使用的样本应冷冻保存。
样本稀释倍数: 1 倍
(b)水产品处理方法
1、称取 2±0.05g 均质组织样品于 50ml 离心管中, 加入 6ml 样品提取液(配液 1),2g 无水硫酸 钠,振荡 5min ,室温(25℃左右)4000r/min以上离心 10min;
2、取 3ml 上清液,加入 20µl 氧化剂,摇匀,在 56℃ 条件下氮气或空气流吹至*干燥;
3、加入 1ml 正己烷,加入 1ml 样品复溶液(配液
2),振荡摇匀 1min,4000r/min 以上离心 5min;
4、取下层 50 µl 用于分析;
样本稀释倍数: 1 倍
注:此方法所得到的结果为孔雀石绿;隐性孔 雀石绿;结晶紫;隐性结晶紫的总量。
六、酶标免疫分析程序:
测定前应须知:
1、 使用前将需用试剂和板条的温度回升至室温 (20~25℃)。
2、 使用之后立即将所有试剂放回 2~8℃。
3、 在 ELISA 分析中的再现性,很大程度上取决于 洗板的*性,正确的洗板操作是 ELISA 测定 程序中的要点。
4、 所有恒温孵育过程,避免光线照射,用盖板膜 盖住微孔板。
操作步骤:
1、从 2~8℃冷藏环境中取出所需试剂,室温(20~ 25℃)平衡 30min 以上,注意每种液体试剂使 用前均须摇匀。
2、取出框架及需要数量的微孔,将不用的微孔放 入自封袋,保存于 2-8℃。
3、配液 1:将 40ml 浓缩洗涤液(20 倍浓缩)用去 离子水按照 1:19 稀释(1 份浓缩洗涤液+19 份 去离子水),或按所需用量配制洗涤液。
配液 2:
配制孔雀石绿标准液:取一定量的 10 倍浓缩
标准液用样品复溶液 10 倍稀释,现配现用, 具体如下:
标准液6:配制4.05ppb 标准液--取50ul 40.5ppb标准液加 450ul 样品复溶液混匀;
标准液5:配制1.35ppb 标准液--取50ul 13.5ppb标准液加 450ul 样品复溶液混匀;
标准液 4:配制 0.45ppb 标准液--取 50ul 4.5ppb标准液加 450ul 样品复溶液混匀;
标准液 3:配制 0.15ppb 标准液--取 50ul 1.5ppb标准液加 450ul 样品复溶液混匀;
标准液 2:配制 0.05ppb 标准液--取 50ul 0.5ppb标准液加 450ul 样品复溶液混匀;
标准液 1:配制 0ppb 标准液--取 50ul 0ppb 标准液加 450ul 样品复溶液混匀;
4、编号:将样本和标准品对应微孔按序编号,每 个样本和标准品做 2 孔平行,并记录标准孔和 样本孔所在的位置。
5、加标准品/样本 50µl/孔到各自的微孔中,然后加 入抗体工作液 50µl/孔,用盖板膜封板,轻轻振 荡混匀。25℃环境中反应 30min。
6、将孔内液体甩干,用已稀释的洗涤液 250µl/孔 洗板 4~5 次,每次间隔 15~30 秒,用吸水纸 拍干(拍干后未清除的气泡可用干净的枪头刺 破)。
7、每孔加入酶标记物 100µl,盖板膜盖板后置25℃ 环境中反应 30min。将孔内液体甩干,用洗涤 液充分洗,4~5 遍(同上),用吸水纸拍干(拍 干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破)。
8、显色:加入底物 A 液 50µl/孔,再加入底物 B 液 50µl/孔,轻轻振荡混匀,25℃环境中避光显 色 15min。
9、测定:加入终止液 50µl/孔,轻轻振荡混匀,设 定酶标仪于 450nm 处(建议用双波长 450/630n m 检测,5min 内读数),测定每孔 OD 值。
七、结果判定
结果判定有两种方法,粗略判定可用第 1 种方 法,定量判定用第 2 种方法。注意样本吸光度值与 其所含孔雀石绿量成负相关。
1、粗略判定:
用样本的平均吸光度值与标准值比较即可得出 其浓度范围(ng/ml)。假设样本 1 的吸光度值为 0.3, 样本 2 的吸光度值为 1.0,标准液吸光度值分别是:
0ppb 为 2.243;0.05ppb 为 1.816;0.15ppb 为 1.415; 变质。
0.45ppb 为 0.74;1.35ppb 为 0.313;4.05ppb 为 0.155。 8、该试剂盒zui佳反应温度为 25℃,温度过高或过
则样本 1 的浓度范围是 1.35ppb~4.05ppb;样本 2的浓度范围是 0.15ppb~0.45ppb,乘以其对应的稀 释倍数即为样本中孔雀石绿实际浓度。
2、定量分析
(1)百分吸光率的计算,标准品或样本的百分 吸光率等于标准品或样本的吸光度值的平均值(双 孔)除以*个标准(0 标准)的吸光度值,再乘 以 100%,即
B
百分吸光率(%)= ×100% B0
低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。
九、储藏条件和保质期
1、储藏条件:试剂盒于 2-8℃保存,不要冷冻。 2、保 质 期:该产品有效期为 1 年,生产日期见
包装盒。
提示:酶标板真空包装袋若有漏气,酶标板仍然正 常有效,不影响实验结果,请放心使用。
B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值 B0—0ng/ml 标准溶液的平均吸光度值
(2)标准曲线的绘制与计算 以标准品百分吸光率为纵坐标,以孔雀石绿标准品浓度(ng/ml)的半对数为横坐标,绘制标准曲 线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中,从标 准曲线上读出样本所对应的浓度,乘以其对应的稀 释倍数即为样本中孔雀石绿实际浓度。
若利用试剂盒专业分析软件进行计算,更便于 大量样本的准确、快速分析。
八、 注意事项
1、室温低于 25℃或试剂及标本未回到室温(20~25℃)会导致所有标准的 OD 值偏低。
2、在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况,则会 伴随着标准曲线不成线性,重复性不好的现象。 所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。
3、混合要均匀,否则会出现重复性不好的现象。
4、反应终止液为 2M 硫酸,避免接触皮肤。
5、不要使用过了有效日期的试剂盒;稀释或搀杂 使用会引起灵敏度、OD 值变化;不要交换使用 不同批号的盒中试剂。
6、不用的微孔板放进自封袋重新密封;标准物质 和无色的发色剂对光敏感,因此要避免直接暴 露在光线下。
7、显色液若有任何颜色表明变质,应当弃之。标 准品 1 的吸光度值小于 0.5 时,表示试剂可能