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GB4789.3-2016 大肠菌群计数及注意事项

时间:2024-04-17      阅读:752

01

大肠菌群定义和卫生学意义


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大肠菌群定义:

在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌。大肠菌群不是细菌学上分类命名,它不代表某一种或某一属的细菌,而是一组与粪便污染有关的细菌。这群细菌包括:埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、产气克雷伯氏菌属、肠杆菌属(又叫产气杆菌属,包括阴沟肠杆菌和产气肠杆菌)和等。

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卫生学意义:

大肠菌群作为粪便污染的指标菌评价样品中是否受到粪便的污染。表示了对人体健康是否具有潜在的危险性。直接反映了样品受粪便污染的程度。

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02

GB4789.3-2016 大肠菌群MPN法

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什么是MPN法?

MPN法是统计学和微生物学结合的一种定量检测法。待测样品经系列稀释并培养后,根据其未生长的zui低稀释度与生长的最高稀释度,应用统计学概率论推算出待测样品中大肠菌群的最大可能数。

MPN值并不能表示实际菌落数,实际菌落数有可能落在置信区间内的任何一点,MPN值是落在这个置信区间内概率最大的一点。

灵敏度较高,适用于污染菌落较少的样品。

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大肠菌群MPN计数的检验操作

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操  作  注  意  事  项

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建议用磷酸盐缓冲液作为稀释液,因为磷酸盐缓冲液能更好地纠正食品样品中pH变化,对细菌具有保护作用。

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初发酵接种量超过1mL,则用双料LST肉汤。

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培养基检查。加入样品前应观察导管内是否有气泡,若有,应适当倾斜试管,让气体排出。

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结果观察。某些食品样品可能会堵塞小导管底部,影响导管内气泡的观察,可将试管微微倾斜,用手指轻弹管壁,观察是否有一串小气泡沿管壁升起,若有,则判定产气。


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培养基原理解析

月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤(LST)

▶ 月桂基硫酸盐能抑制革兰氏阳性菌生长,胰蛋白胨提供碳源和氮源满足细菌生长的需求;氯化钠可维持均衡的渗透压;乳糖是大肠菌群可发酵的糖类;磷酸二氢钾和磷酸氢二钾是缓冲剂。

▶ 36±1℃培养24h后若已产气,则可停止培养。如果没有观察到有产气的现象,则继续培养至48±2h。

▶ 如接种量超过1mL,则用双料LST肉汤。

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煌绿乳糖胆盐肉汤(BGLB)

▶ 胆盐与煌绿均能抑制革兰氏阳性菌生长。

▶ 培养基配方当中含有胆盐,大肠菌群发酵乳糖所产的酸会与胆盐发生反应,形成胆酸沉淀。培养基可由原来的绿色变为黄色。

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大肠菌群最大可能数(MPN)报告

确证的大肠菌群BGLB阳性管数,检索MPN表,报告每1g(mL)样品中大肠菌群的MPN值

当实验结果在MPN表中无法查找到MPN值时,如:阳性管数为122,123,232,233等时,建议增加稀释度(可做4~5个稀释度),使样品最高稀释度能达到阴性终点(如果污染程度不能判定,则多加一稀释度),然后再遵循相关的规则进行查找,最终确定MPN值。

表B.1

大肠菌群最可能数(MPN)检索表

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03

GB4789.3-2016大肠菌群计数平板法

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大肠菌群平板计数法流程图

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操  作  注  意  事  项

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平板法相对MPN法来说,结果更加直观精确。长成的一个单菌落也可能来自样品中的2~3或更多个细胞。因此平板菌落计数的结果往往偏低。适用于污染较为严重的样品。

2

从一个样品取样到倾注琼脂平板,应在15分钟内完成。

3

检验所用物品应无菌,无抑菌残留物。

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BGLB确证试验需从VRBA平板上挑起至少10个典型和可疑菌落进行,如平板上菌落数少于10个,则挑取全部典型和可疑菌落进行确证。


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培养基原理解析

结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)

▶ 配方中胆盐和结晶紫抑制革兰氏阳性菌,中性红作为指示剂,在酸性条件下为紫红色。

▶ 大肠菌群分解乳糖所产的酸与胆盐结合,可形成粉红色菌落菌落周围有胆酸盐沉淀环。

▶ 该培养基无需高温高压灭菌,现配现用。

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计数典型和可疑菌落数

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大肠菌群定义:

选取菌落数在15CFU~150 CFU之间的平板,分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色,菌落周围有红色的胆盐沉淀环,菌落直径为0.5mm或更大。

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证实试验:

从各样品中接种同一样品浓度的VRBA平板上共挑取10个不同类型的典型和可疑菌落,分别移种于BGLB肉汤管内,36℃±1℃培养24h~48h,观察产气情况。凡BGLB肉汤管产气,即可报告为大肠菌群阳性。

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大肠菌群平板计数的报告

经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以计数的平板菌落数,再乘以稀释倍数,即为每g(mL)样品中大肠菌群数。例:10-4样品稀释液1mL,在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落,挑取其中10个接种BGLB肉汤管,证实有6个阳性管,则该样品的大肠菌群数为:

100×6/10×104/g(mL)=6.0×105CFU/g(mL)

若所有稀释度(包括液体样品原液)平板均无菌落生长,则以小于1乘以zui低稀释倍数计算。

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质量控制

实验室过程中,每批样品稀释液都要做空白对照。

为了控制环境污染,每次检验过程中,于检验台上打开两块计数琼脂平板,并在检验环境中暴露不少于15分钟,将此平板与本批次样品同时进行培养,以掌握检验过程中是否存在来自检验环境的污染。

定期使用大肠埃希氏菌ATCC25922或相应定量活菌参考品,在P2实验室或阳性对照实验室内,用适当的食品样品进行阳性实验验证,并进行记录,次验证实验至少每2个月进行1次。

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05

大肠菌群测试片法

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原理

大肠菌群检测片由轻便防水纸质材料做支撑,其上覆盖干燥培养基层(营养物质、凝固剂、选择抑制剂、显色剂)和透明隔水膜组成,经辐照灭菌。可用于食品、饮料等的大肠菌群计数。含有四氮唑指示剂菌落为红色,发酵乳糖产酸和产气。

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培养基原理解析

菌落计数特别方便(容易判读),红色菌落,易于食品颗粒分开,无菌落重叠现象;

菌落分布特别均匀;

避免了培养基对细菌热损伤有关;

菌落蔓延或半透明菌膜现象很少发生;

经济环保无粉尘,体积小,重量轻,易储运;

保质期长干制无水培养基,性质稳定,保质期更长。

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使用说明

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所需培养基试剂和质控菌株

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