GB4789.3-2016 大肠菌群计数及注意事项
时间：2024-04-17 阅读：831
01
大肠菌群定义和卫生学意义
大肠菌群定义：
在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌。大肠菌群不是细菌学上分类命名，它不代表某一种或某一属的细菌，而是一组与粪便污染有关的细菌。这群细菌包括：埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、产气克雷伯氏菌属、肠杆菌属（又叫产气杆菌属，包括阴沟肠杆菌和产气肠杆菌）和等。
卫生学意义：
大肠菌群作为粪便污染的指标菌评价样品中是否受到粪便的污染。表示了对人体健康是否具有潜在的危险性。直接反映了样品受粪便污染的程度。
02
GB4789.3-2016 大肠菌群MPN法
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什么是MPN法?
MPN法是统计学和微生物学结合的一种定量检测法。待测样品经系列稀释并培养后，根据其未生长的zui低稀释度与生长的最高稀释度，应用统计学概率论推算出待测样品中大肠菌群的最大可能数。
MPN值并不能表示实际菌落数，实际菌落数有可能落在置信区间内的任何一点，MPN值是落在这个置信区间内概率最大的一点。
灵敏度较高，适用于污染菌落较少的样品。
2
大肠菌群MPN计数的检验操作
操 作 注 意 事 项
1
建议用磷酸盐缓冲液作为稀释液，因为磷酸盐缓冲液能更好地纠正食品样品中pH变化，对细菌具有保护作用。
2
初发酵接种量超过1mL，则用双料LST肉汤。
3
培养基检查。加入样品前应观察导管内是否有气泡，若有，应适当倾斜试管，让气体排出。
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结果观察。某些食品样品可能会堵塞小导管底部，影响导管内气泡的观察，可将试管微微倾斜，用手指轻弹管壁，观察是否有一串小气泡沿管壁升起，若有，则判定产气。
3
培养基原理解析
月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤(LST)：
▶ 月桂基硫酸盐能抑制革兰氏阳性菌生长，胰蛋白胨提供碳源和氮源满足细菌生长的需求；氯化钠可维持均衡的渗透压；乳糖是大肠菌群可发酵的糖类；磷酸二氢钾和磷酸氢二钾是缓冲剂。
▶ 36±1℃培养24h后若已产气，则可停止培养。如果没有观察到有产气的现象，则继续培养至48±2h。
▶ 如接种量超过1mL，则用双料LST肉汤。
煌绿乳糖胆盐肉汤(BGLB)：
▶ 胆盐与煌绿均能抑制革兰氏阳性菌生长。
▶ 培养基配方当中含有胆盐，大肠菌群发酵乳糖所产的酸会与胆盐发生反应，形成胆酸沉淀。培养基可由原来的绿色变为黄色。
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大肠菌群最大可能数(MPN)报告
确证的大肠菌群BGLB阳性管数，检索MPN表，报告每1g(mL)样品中大肠菌群的MPN值
当实验结果在MPN表中无法查找到MPN值时，如：阳性管数为122，123，232，233等时，建议增加稀释度(可做4~5个稀释度)，使样品最高稀释度能达到阴性终点(如果污染程度不能判定，则多加一稀释度)，然后再遵循相关的规则进行查找，最终确定MPN值。
表B.1
大肠菌群最可能数(MPN)检索表
03
GB4789.3-2016大肠菌群计数平板法
1
大肠菌群平板计数法流程图
操 作 注 意 事 项
1
平板法相对MPN法来说，结果更加直观精确。长成的一个单菌落也可能来自样品中的2~3或更多个细胞。因此平板菌落计数的结果往往偏低。适用于污染较为严重的样品。
2
从一个样品取样到倾注琼脂平板，应在15分钟内完成。
3
检验所用物品应无菌，无抑菌残留物。
4
BGLB确证试验需从VRBA平板上挑起至少10个典型和可疑菌落进行，如平板上菌落数少于10个，则挑取全部典型和可疑菌落进行确证。
2
培养基原理解析
结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)：
▶ 配方中胆盐和结晶紫抑制革兰氏阳性菌，中性红作为指示剂，在酸性条件下为紫红色。
▶ 大肠菌群分解乳糖所产的酸与胆盐结合，可形成粉红色菌落菌落周围有胆酸盐沉淀环。
▶ 该培养基无需高温高压灭菌，现配现用。
3
计数典型和可疑菌落数
大肠菌群定义：
选取菌落数在15CFU~150 CFU之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5mm或更大。
证实试验：
从各样品中接种同一样品浓度的VRBA平板上共挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB肉汤管内，36℃±1℃培养24h~48h，观察产气情况。凡BGLB肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。
4
大肠菌群平板计数的报告
经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每g(mL)样品中大肠菌群数。例：10-4样品稀释液1mL，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：
100×6/10×104/g(mL)=6.0×105CFU/g(mL)。
若所有稀释度(包括液体样品原液)平板均无菌落生长，则以小于1乘以zui低稀释倍数计算。
04
质量控制
实验室过程中，每批样品稀释液都要做空白对照。
为了控制环境污染，每次检验过程中，于检验台上打开两块计数琼脂平板，并在检验环境中暴露不少于15分钟，将此平板与本批次样品同时进行培养，以掌握检验过程中是否存在来自检验环境的污染。
定期使用大肠埃希氏菌ATCC25922或相应定量活菌参考品，在P2实验室或阳性对照实验室内，用适当的食品样品进行阳性实验验证，并进行记录，次验证实验至少每2个月进行1次。
05
大肠菌群测试片法
1
原理
大肠菌群检测片由轻便防水纸质材料做支撑，其上覆盖干燥培养基层(营养物质、凝固剂、选择抑制剂、显色剂)和透明隔水膜组成，经辐照灭菌。可用于食品、饮料等的大肠菌群计数。含有四氮唑指示剂菌落为红色，发酵乳糖产酸和产气。
2
培养基原理解析
菌落计数特别方便(容易判读)，红色菌落，易于食品颗粒分开，无菌落重叠现象；
菌落分布特别均匀；
避免了培养基对细菌热损伤有关；
菌落蔓延或半透明菌膜现象很少发生；
经济环保无粉尘，体积小，重量轻，易储运；
保质期长干制无水培养基，性质稳定，保质期更长。
3
使用说明
06
所需培养基试剂和质控菌株
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