支原体检查培养基基本知识：
支原体(Mycoplasma)是细胞培养过程中常见的外源性污染物，开展支原体污染检测是细胞质量控制微生物学安全性评价体系中的一项重要内容。由于活细胞制剂终产品不能灭菌处理，被支原体污染后不像细菌或者真菌那样容易被肉眼看见，所以在其培养时也很难被观察。因此需要适宜的支原体检测方法。目前，《中华人民共和国药典》规定的支原体检测方法培养法和指示细胞培养法 (DNA染色法)是检测支原体的“金标准”，能够检测不同生长特性的支原体，具有广谱性 。

环凯的精氨酸支原体肉汤培养基（货号：MP01B/MP01BP）和精氨酸支原体半流体培养基（货号：MP01S/MP01SP）可用于检验利用精氨酸的支原体，如口腔支原体等，支原体肉汤培养基（货号：MP02B/MP02BP）和支原体半流体培养基（货号：MP02S/MP02SP）可用于检验利用葡萄糖的支原体，如肺炎支原体等。

支原体检测培养基原理：

精氨酸支原体肉汤培养基：利用口腔支原体分解利用精氨酸产碱使得原本含酚红的橙色培养基变为红色。精氨酸支原体半流体培养基：直接培养口腔支原体于营养物质充足的培养基中，观察其生长及菌落生成。支原体肉汤培养基：肺炎支原体通过葡萄糖代谢路径利用葡萄糖产酸致使原本含酚红的橙色培养基变为淡黄色。支原体半流体培养基：直接培养肺炎支原体接种于营养物质充足的培养基中，观察其生长及菌落生成。

方法来源：

《中国药典》2020年版 3301 支原体检查法

灵敏度检查（变色单位试验法）

器具：

→试管：螺口旋盖试管，利于培养时保持密闭；或者普通玻璃试管，灭菌时使用硅胶塞，培养时换成橡胶塞；或者培养时使用无菌液体石蜡液封。
→新生牛血清或者马血清
→生物安全柜、生化培养箱等。
→培养基配制：
→基础培养基：按标签所示配制方法制备，分装8 mL/支，121℃灭菌15 min，待用。
→完quan培养基：临用前每支8 mL基础培养基中加入2 mL新生牛血清或马血清。

※ 半流体培养基在使用前应煮沸5~10 min，冷却至55℃左右，然后加入新生牛血清或马血清，充分摇匀。

→接种及培养：选取变色的新鲜培养物，接种至待检培养基中，做10倍系列稀释，肺炎支原体稀释至 10⁻⁷~10⁻⁹，接种在支原体肉汤/半流体培养基内；口腔支原体稀释至 10⁻³~10⁻⁵，接种在精氨酸支原体肉汤/半流体培养基内。每个稀释度接种3 支试管，置36±1℃密闭培养7〜14天，观察培养基变色结果。

→结果判定：以接种后培养基管数的 2/3 以上呈现变色的最高稀释度为该培养基的灵敏度。

→阳性案例展示 

   图A：精氨酸支原体肉汤培养结果，左边红色为阳性右边橙色为阴性；

   图B：精氨酸支原体半流体培养结果，左边有菌落悬浮为阳性，右边试管为阴性；
   图C：支原体肉汤培养结果，左边黄色为阳性，右边橙色为阴性；

   图D：支原体半流体培养结果，左边有菌落悬浮为阳性，右边试管为阴性。

注意事项

→灵敏度测定时，支原体活化和传代时建议做阴性对照，肉眼观察到明显的颜色变化时，需尽快进行传代，过度培养会导致支原体的活性明显衰减；

→半流体培养基煮沸融化时以全部溶解为宜，过度加热易导致营养损失，接种时尽量在培养基未凝固，温度约为37℃时接种支原体；

→支原体冻存可以使用10%甘油，冻干保护剂推荐选择6%的蔗糖与1.5%的明胶。