这是一个逐步平衡的过程，因此需经扩散才能达到反应的终点。在其后加入的酶标记抗休与固相抗原的结合也同样如此。这就是为什么ELISA试剂盒反应总是需要一定时间的温育。保温的方式除有的ELISA试剂盒仪器附有特制的电热块外，一般均采用水浴，可将ELISA试剂盒板置于水浴箱中，ELISA试剂盒板底应贴着水面，使温度迅速平衡。为避免蒸发，板上应加盖，也可用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔，此时可让反应板漂浮在水面上。

       在ELISA试剂盒中一般有两次抗原抗体反应，即加标本和加酶结合物后。抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间，这一保温过程称为温育，有人称之为孵育，在ELISA试剂盒中似不恰当。但不宜采用更高的温度。抗原抗体反应4C更为，在放射免疫测定中多使反应在冰箱中过夜，以形成*多的沉淀。但因所需时间太长，

       在ELISA试剂盒中一般不予采用。ELISA试剂盒属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。以抗体包被的夹心法为例，加入板孔中的标本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗结合的机会，只有*贴近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触。若用保温箱，ELISA试剂盒应放在湿盒内，湿盒要选用传热性良好的材料如金属等，在盒底垫湿的纱布，后将ELISA试剂盒板放在湿纱布上。湿盒应先放在保温箱中预温至规定的温度，特别是在气温较低的时候更应如此。无论是水浴还是湿盒温育，反应板均不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡。室温温育的反应，操作时的室温应严格限制在规定的范围内，标准室温温度是指20~25℃，但具体操作时可根据说明书的要求控制温育。室温温育时，ELISA试剂盒只要平置于操作台上即可。应注意温育的温度和时间应按规定力求准确。为保证这一点，一个人操作时，一次不宜多于两块板同时测定。