mRNA疫苗相关产品-起发生物

起发生物提供mRNA 核苷和酶原料 mRNA合成技术服务助力核酸药物，向世界产品看齐。

关键词  mRNA 核苷 ，mRNA核心原料，高产量T7酶 ，高产率mRNA, mRNA合成，mRNA疫苗，mRNA药物，mRNA解决方案，mRNA定制，mRNA CRO，N1-UTP（甲基假尿苷），P-UTP，Pseudo-UTP（假尿苷）

一 mRN药物简介

基于mRNA的治疗，简单来讲就是利用化学修饰后的mRNA分子进入细胞质中，利用细胞质内的自有核苷酸进行转录表达，生成机体所需要的蛋白质。上世纪90年代，mRNA药效被初步证实，之后大量的精力投入到了mRNA药物的研发中。

mRNA药物开发的主要技术门槛在于稳定性和递送，若相关难点能够得以解决，mRNA药物就可作为蛋白质补充或替代疗法治疗相关疾病。尤其是随着癌症基因测序和抗原表位发现等技术的发展，mRNA药物也可用于针对肿瘤患者的个性化治疗，并具有巨大的应用潜力。目前在mRNA肿瘤药物开发领域进展较快的企业主要是Moderna、BioNTech和CureVac。

二、mRNA合成过程所需原料

（一）国内外mRNA X冠疫苗的合成工艺

BioNTech/辉瑞、Moderna和艾博生物mRNA疫苗的合成工艺如下：

1）BNT162b2–BioNTech/辉瑞

三核苷酸cap1类似物（（m27,3′-O）Gppp（m2'-O）ApG）（TriLink）和N1-甲基假尿苷-5′-三磷酸（m1ψTP）（ThermoFisherScientific）取代尿苷-5′-三磷酸（UTP）的存在下，通过T7RNA聚合酶对DNA进行纯化和体外转录。

总结：转录采用一步法，帽子类似物作引物；甲基假尿苷取代尿苷。

2）mRNA-1273–Moderna

利用优化的T7RNA聚合酶介导的转录反应在体外合成了编码序列优化的mRNA，尿苷被N1-甲基假尿苷*取代。转录后，使用牛痘苗封盖酶（新英格兰生物实验室）和痘苗2′O-甲基转移酶（新英格兰生物实验室）将Cap1结构添加到5’端。通过oligodT亲和纯化纯化mRNA，通过切向流过滤将缓冲液交换到pH为5.0的醋酸钠中，无菌过滤，并在-20°C下冷冻，直到进一步使用。

总结：转录采用两步法，需要加帽酶的参与，甲基假尿苷取代尿苷。

3）ARCoV-艾博生物

该mRNA在体外使用T7RNA聚合酶介导的转录从质粒ABOP-028（GENEWIZ）的线性化DNA模板中产生，该质粒编码SARS-CoV-2的密码子优化RBD区域，并包含5’和3‘的未翻译区域（UTR）和一条poly-a尾巴，以未修饰的NTP作为原料和T7聚合酶体外进行mRNA的合成，使用了牛痘加帽系统（VacciniaCappingSystem）(Novoprotein)进行加帽。

总结：转录采用两步法，需要加帽酶的参与。

（二）mRNA制备过程原料

mRNA制备过程需要用到的主要原料包括质粒DNA模板、一系列酶（主要为7种酶）以及底物核苷酸等;

1、模板DNA所需原料：质粒

DNA模板生产，主要是质粒的生产。编码抗原的DNA模板，通过质粒转染到大肠杆菌大规模体内表达，最后提取和纯化携带目的序列的质粒，即得到DNA模板。目前质粒的生产提取和纯化工艺很成熟，可以自建生产线或者外包出去，例如辉瑞自建质粒生产工厂，大部分mRNA企业外包，Moderna和国内企业目前是外包。

制备mRNA质粒的要求：质粒用于制备mRNA，这类DNA本身不属于API，DNA需要按照GMP规范进行，GMP质粒要求生产设备必须是专用的、符合GMP规范且配备洁净间

2、mRNA体外转录所需原料：一系列酶+核苷酸底物

mRNA疫苗的研发与生产需要一系列酶的参与：mRNAT7聚合酶、无机焦磷酸酶、RnaseInhibitor、加帽酶以及2′O-甲基转移酶、Poly(A)聚合酶和DNAase等主要7种酶。

起发生物提供全线mRNA体外转录原料 如下表：

2.1转录过程所需要的酶

RNA聚合酶体系：RNA聚合酶是体外转录mRNA的关键酶。

T3、T7和SP6RNA聚合酶分别对T3、T7和SP6噬菌体启动子具有高度的特异性。将目的基因序列克隆到T7和SP6启动子下游的多克隆位点中，以克隆的DNA为模板体外合成相应的RNA。

T7RNAPolymerase（T7RNA聚合酶）【78MRNA-1104】高度特异识别T7启动子序列，以含有T7启动子序列的单链或双链DNA为模板，以核甘酸（NTP）为底物，合成与启动子下游的单链DNA互补的RNA。

无机焦磷酸酶【78MRNA-1109】：加入无机焦磷酸酶，增加RNA产量。无机焦磷酸酶（PPase）可催化无机焦磷酸盐水解生成正磷酸盐，可以为蛋白、RNA和DNA的生物合成反应提供动力，促进产物的生成。在工业化生产mRNA疫苗的时候会产生大量的无机焦磷酸盐，为了保证mRNA疫苗高效生产，可以添加无机焦磷酸酶，可解除生成的无机焦磷酸盐对反应体系的抑制。

RNase抑制剂【78MRNA-1103/78DA10001】：防止RNA的降解。少量RNase在RNA制备过程中引入，会导致RNA的降解，污染可能通过实验过程中使用的枪头、试管（离心管）和其他试剂引入。通常使用RNase抑制剂作为减少和控制此类污染物的预防措施。

RNase抑制剂能与RNaseA形成1:1复合体，抑制RNase活性，在mRNA疫苗研发和生产过程需要保持mRNA的稳定性以保证疫苗高质量的生产。

2、转录所需材料-核苷酸和修饰核苷酸

mRNA疫苗研发中常进行假尿嘧啶化修饰，尿嘧啶修饰是丰富的RNA修饰，一般由尿苷的异构化产生，mRNA的假尿嘧啶化修饰主要有三个功能：改变密码子、增强转录本稳定性和应激反应应答。

3、加帽和加尾：共转录加帽/模板加尾，转录后加帽/加尾

真核生物体内会对转录形成的mRNA进行加帽，即在mRNA的5’端添加一个甲基化的鸟苷酸帽子（m7GPPPN结构），从而保护mRNA免遭核酸外切酶的攻击以增加mRNA的稳定性，并且协助mRNA与核糖体的结合以促进翻译起始。生物体内的帽子结构有cap0，cap1，cap2三种形式，牛痘病毒加帽酶能够在mRNA的5’端添加cap0帽子，再使用甲基转移酶处理即可得到cap1帽子。

此外，5'帽子还参加mRNA前体的剪接，参与mRNA3'末端多聚腺苷酸化，保证mRNA在细胞质中的稳定运输。

加帽需要的酶：牛痘病毒加帽酶

可以将7-甲基鸟苷帽结构（m7Gppp，Cap0）加到RNA的5末端，大幅提高mRNA的稳定性和启动mRNA的翻译。牛痘病毒加帽酶能够在一小时之内对mRNA进行加帽，效率接近100%。

在mRNA疫苗研发生产过程中，mRNA加帽效率和加帽mRNA稳定表达的效率对疫苗的工业化生产有重大的影响。牛痘病毒加帽酶体系加帽的mRNA在细胞内的表达效率大于帽子类似物mRNA的表达效率。

加尾酶：Poly(A)聚合酶

Poly(A)聚合酶可以催化ATP以AMP的形式依次掺入到RNA的3末端，即在RNA的3末端加多聚A尾。Poly(A)尾巴能够增强mRNA的稳定性、提高翻译起始效率、引导mRNA出核。

主要用到的酶：

1）牛痘病毒加帽酶【78MRNA-1105】：

2）痘苗2′O-甲基转移酶【78MRNA-1106】

3）Poly(A)聚合酶

加帽酶非常昂贵，如何替代加帽酶？

一步法合成mRNA疫苗产品的加帽可以在mRNA的体外转录过程中通过掺入“帽子序列”实现，这种加帽技术会将加帽序列反向加在mRNA上，在反应体系中加入5’帽类似物，可以省一个加帽酶，以及减少纯化步骤，一定程度上降低成本（尤其是节省了昂贵的加帽酶成本），但相对应地，产量较之两步法（加帽酶参与）减少，因为加帽酶的加帽效率更高。

4、消除DNA模板：需要DNA酶【78MRNA-1110】

合成后的产物可能会有DNA残留，在疫苗开发阶段，残留的去除是关键的步骤，以减少下游纯化难度并增加产品的纯度。需要用DNA酶（DNAase将残留的DNA模板进行消除，在mRNA疫苗生产的过程中对DNA的残留控制非常严格格。

三、mRNA高品质

3.1 修饰核苷酸/核苷酸质量标准

依据国际标准进行质量检测和质量控制：

• 良好品质：产品纯度可达99%以上，且批次间质量稳定；

• 无动物源成分：合成过程中不引入动物源成分，降低病毒污染风险；

• 无污染：每批次产品均通过DNA酶、RNA酶及内毒素检测，确保产品合成过程未引入外源无污染；

• 表达效率保证：产品经过转录测试和表达测试，转录活性和表达活性优于同类产品；

• 工业级产能：修饰核苷酸产能可满足工业级应用，满足核酸药物从药物开发到工业级生产的不同需求。

  起发Pseudo-UTP纯度： 99.2%

Me-Pseudo-UTP纯度纯度99.8%

3.2 酶质量标准

• mRNA合成酶系列产品，依据国际标准进行质量检测和质量控制：

• 良好品质：产品纯度可达95%以上，质控精度优于国产同类产品；

• 定量检测：采用定量检测方法检测DNA酶、RNA酶残留，精准定量微量残留；

• 杂质控制：每批次产品均通过DNA酶、RNA酶残留检测，检测精度可达百万分之一酶活单位；

• 严防污染：生产过程中不引入动物源成分，每批次产品均通过HIV、HBV、HCV检测；

• 活性保证：产品经过酶活测试，酶活达到行业标准。

  RNA酶抑制剂纯度100%

   

  

   

  牛痘加帽酶纯度99.99%

  
  

   

  T7聚合酶酶纯度100%

  
  

  

   

  二氧甲基转移酶纯度99.46%