维生素B1（Vitamin B1，VB1）试剂盒说明书
时间：2020-03-06 阅读：2376
维生素B1（Vitamin B1，VB1）试剂盒说明书
分光光度法
50管/48样 注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。 测定意义 维生素B1（Vitamin B1）是构成脱羧辅酶的主要成分，参与细胞代谢中的三羧酸循环，是维持机体正常代谢必须的水溶性维生素，在生物体能量代谢中有重要的作用。 测定原理 VB1在碱性条件下还原。。。。。。。。。与Fe3+在弱酸条件下生成普鲁士蓝，在704nm有特征吸收峰。 自备实验用品及仪器 天平、研钵、离心机、可见分光光度计、恒温水浴锅、1 mL玻璃比色皿、蒸馏水。 试剂组成和配制 提取液：液体35mL×1瓶，4℃保存。 试剂一：液体1mL×1瓶，4℃保存。 试剂二：液体5mL×1瓶，4℃保存。 试剂三：液体5mL×1瓶，4℃避光保存。 试剂四：液体12mL×1瓶，4℃保存。 试剂五：液体6mL×1瓶，4℃避光保存。 样本处理
1. 组织：将样品磨碎，按照质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入0.6mL提取液）加入提取液，60℃浸提30min，加蒸馏水0.4mL，混匀后于25℃，13000g离心10min，取上清测定（动物组织等蛋白含量较高的样本建议离心20-30分钟）。
2. 细胞：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入0.6mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；加蒸馏水0.4mL，混匀后于25℃，13000g离心10min，取上清测定。
3. 血清：直接测定。
测定操作
空白管
测定管
样品（μL）
0.1
试剂一（μL）
100
试剂二（μL）
80
80
试剂三（μL）
100
100
充分混匀，80℃反应10min
提取液（μL）
80
80
试剂四（μL）
220
220
试剂五（μL）
120
120
H2O（μL）
300
300
充分混匀，静置20min，于1mL玻璃比色皿，蒸馏水调零，测定704nm处吸光值，记为A空白管和A测定管，△A=A测定管-A空白管。
计算公式 标准曲线：y = 0.1902x - 0.1833，R2 = 0.9991 1. 按照蛋白含量计算
VB1含量（μg/mg prot）=（△A +0.1833）÷ 0.1902×V反总÷（V样×Cpr） = 52.58×（△A +0.1833）÷ Cpr 2. 按照样本质量计算 VB1含量（μg/g）=（△A +0.1833）÷ 0.1902×V反总÷（V样×W÷V样总） = 52.58×（△A +0.1833）÷ W 3. 按照细胞数量计算 VB1含量（μg/104 cell）=（△A +0.1833）÷ 0.1902×V反总÷（V样×细胞数量÷V样总） = 52.58×（△A +0.1833）÷ 细胞数量 4. 按照液体体积计算 VB1含量（μg/mL）=（△A +0.1833）÷ 0.1902×V反总÷V样 = 52.58×（△A +0.1833） V反总：反应总体积，1mL；：V样：加入样本体积，0.1mL；V样总：加入提取液体积，1mL； Cpr：蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g 注意事项
1. 若测定结果中吸光值超过1，请将样本稀释后进行测定，并在计算公式中乘以稀释倍数。
2. 蛋白浓度较高的样品，比如动物组织，若显色完成后有沉淀产生，将样本稀释后再测定，在计算公式中乘以稀释倍数。
3. 显色完成后立即进行测定。