Ni琼脂糖凝胶说明书

Ni-Agarose Resin for 6×His-Tagged Proteins 

目录号：  K0010       

保    存：  20%乙醇中          2-8℃保存 

组分说明 

                     Cat.No.        K0010A         K0010C

                     Volume           10ml         100ml

产品简介

      该镍柱纯化系统对6×His-tag 蛋白具有显著特异吸附能力，能够高效一步纯化带有 6 个组氨酸亲和标签的蛋白。该系统具有4 个 Ni2+ 螯合位点，较只有3 个螯合位点的Ni-IDA 结合Ni2+更为牢固，有效防止纯化过程中Ni2+脱落且增强对His 标签蛋白的结合能力，提高纯化效率。较高的基团密度，大大提高了蛋白载量。该系统在天然或变性条件下，对来源于各种表达系统（如杆状病毒，哺乳细胞，酵母以及细菌）中的 His 标签蛋白，均有很好的纯化效果。本产品已螯合镍离子，可直接使用，方便，快捷。

支持物：CL-6B 琼脂糖凝胶

      载量：20-30mgHis标签蛋白/ml 填料

      粒径：50-160μm

注意事项 

 1. 缓冲液中不建议使用β-巯基乙醇、DTT 和EDTA。

 2. 整个纯化过程中切忌凝胶脱水变干。

 3. 为提高纯化效率，首先确定BindingBuffer 和  ElutionBuffer 中咪唑的最-#佳使用浓度。可以使用线性或梯度浓度的咪唑（20-500mM）洗脱蛋白，并通过SDS-PAGE 或 WesternBlotting 来检测目的蛋白的纯度。

 4. 请使用高纯度的试剂配制缓冲液，并通过0.45µm 过滤器过滤。为避免柱子被堵塞，建议将裂解液进行离心，或者使用 0.45µm 过滤器过滤。

 5. 柱再生时，保证每步洗完后都要用足够的去离子水冲洗至中性。

操作步骤 

组装层析柱 

 1. 将填料混匀后加入层析柱，室温静置10 分钟，待凝胶与溶液分层后，把底部的出液口打开，让乙醇通过重力作用缓慢流出。

 注意：（1）填料的上层是乙醇保护层，将填料和乙醇一起混匀，以每ml填料纯化20-30mgHis标签蛋白计算，取需要的填料与乙醇的混合液加入层析柱。

（2）如果乙醇不流出，可以给柱子一个外力，例如用大拇指对柱口轻轻按压一下，迫使乙醇流出。                                                        

（3）本实验都是通过重力作用使溶液流出。

 2. 向装填好的柱中加入5 倍柱体积的去离子水将乙醇冲洗干净后，再用 10 倍柱体积的Binding Buffer  平衡柱子，平衡结束后即可上样。

 注意：柱体积指的是填料的体积。

I  可溶性蛋白的纯化（SolubleBindingBuffer和SolubleElutionBuffer配方详见附表1） 

 1.  收集菌体后，每100mg菌体（湿重）加入1-5 ml细菌裂解液，超声裂解菌体。

 2.  将菌体裂解液负载上柱，流速为10倍柱体积/小时。

 3.  使用15倍柱体积的Soluble Binding Buffer冲洗柱子，收集流穿峰。

 4.  使用5倍柱体积的Soluble Elution Buffer洗脱，收集洗脱峰。

 5.  洗脱后，依次使用3倍柱体积的Soluble Binding Buffer和5倍柱体积的去离子水洗涤柱子，再用3倍柱体积的20%乙醇平衡（乙醇要将填料浸没），4℃保存。

II  包涵体蛋白的纯化（InclusionBodyBindingBuffer和 InclusionBodyElutionBuffer配方详见附表2） 

 1. 收集菌体后，每100mg菌体（湿重）加入1-5 ml  细菌裂解液，超声裂解菌体。

 2. 离心，弃上清，将沉淀重悬于Soluble Binding Buffer中（如有需要，可进行超声波处理，超声前可加入1-5mM磷酸酶抑制剂混合物）。

 3. 重复操作2，直至包涵体清洗干净（呈较洁净的乳白色状）。

 4. 将沉淀重悬于Inclusion BodyBinding Buffer中，冰浴1小时，使包涵体溶解。

 5. 10,000×g离心20分钟，将上清以孔径为0.45 μm的滤膜过滤。

 6. 将蛋白溶液负载上柱，流速为10倍柱体积/小时。

 7. 使用15倍柱体积的Inclusion BodyBinding Buffer冲洗柱子，收集流穿峰。

 8. 使用5倍柱体积的Inclusion Body Elution Buffer洗脱，收集洗脱峰。

 9. 洗脱后，依次使用3倍柱体积的Inclusion BodyBinding Buffer和5倍柱体积的去离子水洗涤柱子，再用3倍柱体积的20%乙醇平衡（乙醇要将填料浸没），4℃保存。

     注意：在纯化包涵体蛋白时，所有缓冲液均含有变性剂，需要降低 BindingBuffer 中的咪唑浓度（5mM 或更低）。洗脱时，若蛋白在较高pH下洗脱失败，可以选用低 pH 缓冲液作为洗脱缓冲液（pH6.5，pH5.9 或 pH4.5）。 柱再生 当填料使用多次后，结合效率会有所下降（表现为流速变慢或填料失去蓝绿色），可以用以下方法再生，提高填料的使用寿命和蛋白质的结合效率。

 1. 使用2 倍柱体积的6M  盐酸胍冲洗后，使用3 倍柱体积的去离子水冲洗。

 2. 使用 1 倍柱体积2% SDS 冲洗。

 3. 依次使用 1 倍柱体积的25%、50%、75%和5 倍柱体积100%乙醇冲洗，再依次使用 1 倍柱体积的75%、50%、25%的乙醇冲洗。

 4. 使用 1 倍柱体积的去离子水冲洗。

 5. 使用 5 倍柱体积含50 mM EDTA 缓冲液（PH8.0）冲洗。

 6. 使用 3 倍柱体积去离子水，3 倍柱体积20%乙醇冲洗。

 7. 4°C 保存。

 8. 再次使用前，需首先使用10 倍柱体积去离子水冲洗，然后使用5 个柱体积的      50 mM NiSO4再生，3 个柱体积的Binding Buffer   平衡。

 1: 蛋白分子量标准  

（分子量由大到小分别为：90/66/45/27/  14.4kDa）

2: 全菌裂解液

 3: 流穿收集液

 4: 洗脱收集液    

1（洗脱缓冲液，含     500mM   咪唑，收集第1 个柱体积）

 5: 洗脱收集液

2（洗脱缓冲液，含 500mM 咪唑，收集第 2 个柱体积）

 6: 洗脱收集液

3（洗脱缓冲液，含500mM咪唑，收集第3 个柱体积）

7: 洗脱收集液

 4（洗脱缓冲液，含500mM 咪唑，收集第 4 个柱体积）

 附表 

 附表  1. 可溶性蛋白纯化缓冲液配方

                                                         

成分                    Tris-HCl（PH7.9）   咪唑            NaCl

SolubleBindingBuffer              20mM      10mM       0.5M

SolubleElutionBuffer              20mM        500mM     0.5M



    

附表  2. 包涵体蛋白纯化缓冲液配方

 成分                 Tris-HCl（PH7.9）    咪唑    NaCl     尿素/盐酸胍

InclusionBodyBindingBuffer      20mM     5mM  0.5M    8M/6M

InclusionBodyElutionBuffer       20mM   500mM   0.5M    8M/6M

    

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