GST琼脂糖凝胶说明书

Glutathione-Triethyleneglycocyl-Sepharose 6B 

目录号：K0190       

保存：20%乙醇中2-8  ℃保存 

组分说明 

                                        Cat.No.       K0190      K0190A

                                        Volume          2ml      10ml

产品简介

    本产品为基于三甘醇（16 原子间隔臂）的谷胱甘肽琼脂糖，可快速、温和, 特异性地纯化包含谷胱甘肽结合序列的非变性蛋白质，如谷胱甘肽-S-转移酶（GST）、谷胱甘肽过氧化物酶等，尤其适用于在大肠杆菌、昆虫细胞和哺育动物细胞中表达的GST 融合表达蛋白。该填料具有很好的物理和化学稳定性，使用寿命长，使用方便，批次重复性好，可一步分离得到纯度较高的目标蛋白，纯化条件温和，可以保证蛋白的活性。

载量：5-10mgGST 标签蛋白/ml 填料

支持物：CL-6B 琼脂糖凝胶

粒径：50-160 μm

注意事项 

1. 请勿将GST凝胶冷冻、干燥和离心，整个纯化过程中切忌凝胶脱水变干。

2. 蛋白层析应使用高纯度的试剂和水，层析前缓冲液应用0.45µm 滤膜过滤后使用。另外为防止柱子阻塞，上柱前建议将裂解液进行离心，或者使用0.45µm 滤膜过滤。

3. GST 融合蛋白与还原型谷胱甘肽的结合比较缓慢，为获得最+*大结合量，上样流速建议为：0.2-1ml/分钟 (6ml 层析柱），0.5-2ml/分钟（12ml 层析柱）。对于吸附效果不好的样品，可以先把介质和样品混合，轻轻振摇 2-4 小时，再装柱，用平衡缓冲液进行重新平衡、洗脱等操作，另外在细菌抽提试剂中添加5mMDTT，可以显著提高 GST 标签结合能力

4. 不同的GST融合蛋白取得最+*佳纯化效果所需还原型谷胱甘肽浓度、洗脱体积和洗脱时间可能有所不同。必要时需对流穿液、洗脱液进行 SDS-PAGE 以及 Western 杂交分析，以确定最+*佳纯化条件。

5. GST 融合蛋白以包涵体形式存在时不能与介质结合，必须先进行变性、复性、透析处理后才能用介质进行纯化。建议优化蛋白表达条件尽量使蛋白可溶性表达。

6. 如后续实验需要除去洗脱液中还原型谷胱甘肽，可采用超滤或透析的方法。

自备仪器和试剂 

    紫外蛋白监测仪、细菌蛋白抽提试剂盒、再生缓冲液1和再生缓冲液2

溶液配制 

结合缓冲液（PBS）：10mMNa2HPO4，1.8mMKH2PO4，140mMNaCl，2.7mMKCl，pH7.4

洗脱缓冲液：10mMNa2HPO4，1.8mMKH2PO4，140mMNaCl，2.7mMKCl，10mM还原型谷胱甘肽（GSH），pH7.4。将0.1g还原型谷胱甘肽（GSH）溶于30ml 结合缓冲液，或将0.25g 溶于   75ml 结合缓冲液中。

再生缓冲液 1（自备）：0.1MTris-HCl，0.5MNaCl，0.1%SDS，pH8.5

再生缓冲液2（自备）：0.1MSodiumacetate，0.5MNaCl，0.1%SDS，pH4.5

操作步骤  

样本制备 

1. 收集菌体后，每100 mg 菌体（湿重）加1-5 ml 细菌蛋白抽提试剂（每1 ml 细菌蛋白抽提试剂中加入10 μl 蛋白酶抑制剂混合物），如有需要可以超声裂解菌体。

注意：1） 当提取物粘度高时，建议加入DNaseI 和 Lysozyme。每1ml 细菌抽提试剂中加入1μlDNaseI（ 1 , 0 0 0 U / m l ），2  μ l L y s o z y m e（50mg/ml），DNaseI 和Lysozyme 可单独从我公司购买，货号：Lysozyme(#K0887)、 DNaseI(K2090A)，或直接从我公司购买K0888 细菌蛋白抽提试剂盒，包含细菌蛋白抽提试剂、DNaseI、Lysozyme 和蛋白酶抑制剂混合物。

2）超声过程中保持菌液处于冰浴中，超声条件依赖于所使用的超声仪功率，探头种类，容器的大小形状，需实验中自己摸索，应避免连续超声导致溶液过热，可分成短时间，多次超声，最-*终以菌液变清即可。 

2. 10,000 rpm，4℃离心15 分钟，将上清转移至新的已预冷的离心管中，然后用预冷的 PBS Buffer 重悬沉淀(每50 ml裂解液的沉淀加入3mlPBS)。

3. 分别取10μl 上清和沉淀悬液进行SDS-PAGE 电泳检测，以确定蛋白存在于上清或沉淀中。若目的GST 融合蛋白形成包涵体(不可溶蛋白)，应在纯化以前以适当的方式进行溶解和重折叠。组装层析柱 

1. 将  GST-Agarose 填料混合均匀直至重悬，用吸管移取适量的填料至层析柱中。室温静置10 分钟，待凝胶与溶液分层后，把底部的出液口打开，让乙醇通过重力作用缓慢流出。

   注意：1）填料的上层是乙醇保护液，将填料与乙醇一起混匀，以每ml 填料纯化   5-10mgGST 标签蛋白计算，取需要的填料与乙醇混合液加入层析柱中。

2）如果乙醇不流出，可以给柱子一个外力，例如用大拇指对柱口轻轻按压一下，迫使乙醇流出。

3）本实验都是通过重力作用使溶液流出。

2. 加入  5 倍柱体积的去离子水洗涤，再用10 倍柱体积的结合缓冲液平衡，平衡结束后即可上样。

注意：柱体积指的是填料的体积。

GST 融合蛋白的纯化 

1.  将层析柱的出口连接上紫外蛋白监测仪，根据紫外蛋白监测仪观察280nm 处的吸收值来监控层析柱流出蛋白情况。 

2.  上样：将制备的蛋白样品用结合缓冲液等体积稀释后，加入到已平衡好的层析柱中，建议上样流速为：0.5-1ml/min(6ml 层析柱），1-2ml/min（12ml 层析柱）。观察280nm 吸收情况并收集流穿蛋白。 

注意：1）样品在上柱前可以离心或 0.45μm 微孔滤膜过滤。或者使用本试剂盒中附带的一块筛板，使用时先将筛板加至填料的上层，该筛板可用于杂质较多的蛋白的过滤，防止过多的杂蛋白堵塞柱子的作用。再将处理好的样品负载上柱，但是筛板放入柱子后就不易取出。 

2）通过控制加入的菌体裂解液的速度或流出速度来控制柱流速，流速过快会影响柱效。 

3. 洗涤：使用10 倍柱体积的结合缓冲液过柱，洗涤杂蛋白，观察280nm 吸收情况并收集杂蛋白。建议洗涤流速为：0.5-1ml/min(6ml 层析柱），1-2ml/min（12ml 层析柱）。

   注意：建议洗涤液中加入蛋白酶抑制剂终浓度为1mM，如蛋白酶抑制剂混合物，以抑制蛋白酶活性。

4. 洗脱：使用10-15 倍柱体积的新鲜配制的洗脱缓冲液过柱，洗脱目的蛋白，观察 280 nm  吸收情况并收集目的蛋白。

   建议洗涤流速为0.5-1ml/min(6ml 层析柱），1-2ml/min（12ml 层析柱）。

5. 蛋白检测：分别取等量的流穿液，洗涤液和目的蛋白洗脱液进行SDS-PAGE 以分析蛋白的层析情况。

6. 洗脱后，依次用3-5 倍柱体积的结合缓冲液和3-5 倍柱体积的去离子水洗涤填料，再用 2-3 倍柱体积的20%乙醇洗涤（乙醇要将填料浸没），4℃保存。

柱再生

当填料使用多次后，结合效率会有下降，可用以下方法再生，提高填料的使用寿命和蛋白质的结合效率。

1. 使用 5 倍柱体积的再生缓冲液 1 洗涤填料，而后用5-10 倍柱体积超纯水洗涤。

2. 使用 5 倍柱体积的再生缓冲液2 洗涤填料，而后用5-10 倍柱体积超纯水洗涤。

3. 保存：使用2-3 倍柱体积的20%乙醇洗涤，将层析柱的头尾密封后（乙醇要将填料浸没）4℃保存。

4. 再次使用时加入5 倍柱体积的去离子水将乙醇洗涤后，使用10 倍柱体积的结合缓冲液平衡填料，平衡结束后即可上样。

问题与方法 

                                                   

1. 蛋白产量低

原因：

a低表达量

b融合蛋白为包涵体

c裂解不充分

d融合蛋白与介质结合能力差

e流速过快

 解决方法： 

a优化表达条件   

b优化细菌培养条件（如：降低温度，改变诱导条件）c充分裂解细胞

d融合的伴侣蛋白改变了GST 空间构象，影响了结合能力。纯化前，在细菌蛋白抽提试剂中添加5mMDTT，可以显著提高GST 标签结合能力。

e降低上样样品流速

                                                         

2. 蛋白纯度低

原因：

a洗涤不充分     

b融合蛋白样品中含其他细菌蛋白

解决方法：

a增加洗涤量：在洗涤液中中添加0.05%NP-40 或提高盐浓度。

b纯化前，在细菌蛋白抽提试剂中添加5mMDTT，减少非特异性吸附。

3. 柱流速缓慢         

原因：

柱超载

解决方法：

降低样品上样量或流速

4. 柱压力过高

原因：

细胞碎片堵柱

解决方法：

离心样品，或用0.45μm滤膜过滤

实验代做服务：