牛肿瘤坏死因子α（TNF-α）ELISA试剂盒使用说明书

本试剂盒仅供研究使用。

检测范围：8ng/L - 240ng/L                                                          

规格：96T

使用目的：

本试剂盒用于测定牛血清，血浆及相关液体样本中肿瘤坏死因子α（TNF-α）含量。

实验原理

本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中牛肿瘤坏死因子α（TNF-α）水平。用纯化的牛肿瘤坏死因子α（TNF-α）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入肿瘤坏死因子α（TNF-α），再与HRP标记的肿瘤坏死因子α（TNF-α）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过*洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成终的黄色。颜色的深浅和样品中的肿瘤坏死因子α（TNF-α）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中牛肿瘤坏死因子α（TNF-α）浓度。

试剂盒组成

标本要求 

1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融

2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

牛肿瘤坏死因子α（TNF-α）ELISA试剂盒操作步骤

• 标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。

• 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
• 温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。   
• 配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用
• 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
• 加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。
• 温育：操作同3。
• 洗涤：操作同5。
• 显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟.
• 终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
• 测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。

操作程序总结：

计算

  以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

注意事项

1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。

2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。

3．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。

• 请每次测定的同时做标准曲线，建议做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔di一孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请后乘以总稀释倍数（×n×5）。
• 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

6．底物请避光保存。

7．严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.

8．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。

9．本试剂不同批号组分不得混用。

保存条件及有效期

1．试剂盒保存：；2-8℃。

2．有效期：6个月