做山羊环磷酸鸟苷(cGMP)实验的注意事项
时间:2022-08-03 阅读:969
注意:使用前请检查试剂盒中试剂的标签和数量与表格是否一致。
需要但未提供的材料及耗材
1、酶标仪(建议仪器使用前提前预热)
2、精密移液器、吸头、加样槽
3、蒸馏水或去离子水
4、洗瓶或者自动洗板机
5、37℃水浴锅或恒温箱
6、EP管
7、无粉一次性乳胶手套
【储存条件及有效期】
1、2-8℃保存,切勿冷冻,有效期6个月。
2、开封使用后,包被微孔板放入带有干燥剂的自封袋中,密闭自封袋,并将全部试剂放回2-8℃冰箱。
注意:试剂盒内酶标条可拆卸,按实验需求可分多次使用;使用后的剩余试剂盒建议在实验后1 个月内使用完毕。产品过期时间以盒子上的标签为准,保质期内所有组分都确保是稳定的。
【适用仪器】
半自动的酶标仪,如Thermo MK3,或者国产酶标仪。
【样本要求】
1.样本类型和采集
血清:将收集于血清分离管的全血标本在室温放置0.5-2小时或4℃过夜,然后1000×g离心20 分钟,取上清即可,或将上清置于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融。
血浆:用EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本,并将标本在采集后的30分钟内于2-8℃ 1000×g离心15分钟,取上清即可检测,或将上清置于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融。
组织匀浆:用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织,去除残留血液(匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果),称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS(一般按1:9的重量体积比,比如1g的组织样品对应9mL的PBS,具体体积可根据实验需要适当调整,并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂)加入玻璃匀浆器中,于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞,可以对匀浆液进行超声破碎,或反复冻融。最后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟,取上清即可检测,或将上清置于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融。
细胞裂解液: 吸弃培养液,用PBS(0.01 M,pH 7.4)将细胞洗一遍。用细胞刮刮下细胞(不能用胰酶和EDTA 处理),加入2-5 mL PBS(0.01 M,pH 7.4)。悬浮细胞可省略。收集细胞悬液,4℃ 1000×g离心10min,弃去培养基,用预冷的PBS润洗3次。加入适量的预冷PBS或非变性细胞裂解液(临用前加入蛋白酶抑制剂)重悬细胞,通常6孔板一个孔的细胞量需要150-250μL PBS重悬。 将样品放入-20℃或-80℃,使样品冷冻,再放室温解冻样品,反复冻融3次,使细胞充分裂解,也可将样品进行超声破碎,以达到裂解的目的。4℃ 10000×g 离心10min,除去细胞碎片,取上清即可检测,或将上清置于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融。
细胞培养物上清或其它生物标本:请1000×g离心20分钟,取上清即可检测,或将上清置于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融。
2.样本保存和稳定性
样本在2-8℃条件下,可以储存72h,在- 20℃或-80℃可以储存6个月及以上。样本收集后,不是一次检测完,请按一次用量分装冻存,避免反复冻融。
【注意事项】
1. 请每次测定的同时做标准曲线,最好做复孔。如标本中待测物质含量过高(样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值),请先用样品稀释液稀释一定倍数(n倍)后再测定,计算时请最后乘以总稀释倍数(×n×5)。
2. 封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染。
3. 为免交叉污染,要避免重复使用手中的吸头和试管。
4. 要严格避免操作过程中酶标板干燥。干燥会使酶标板上生物成份迅速失活。
5. 严格按照说明书的操作进行,试验结果判定必须以酶标仪读数为准。
6. 显色时间供参考,因用户实验室条件差异,最佳显色时间会有所不同。
7. 所有样品,洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。
8. 本试剂不同批号组分不得混用。
9. 揭封板膜和覆盖封板膜时应避免用力过大导致液体溅出。
【结果计算】
以标准物的浓度为横坐标,OD值为纵坐标,在坐标纸上绘出标准曲线,根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度;再乘以稀释倍数;或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式,将样品的OD值代入方程式,计算出样品浓度,再乘以稀释倍数,即为样品的实际浓度。