一、概述

1 当前细胞培养和观察的常用方法

十九世纪起，当显微镜出现后，人们就开始尝试对细胞结构进行观察，并在二十世纪发展出细胞的培养技术。单层细胞的培养相对方便，而且商业化的显微镜非常适合于平面的、薄样品的观察，所以，在二十世纪的中后期，人们普遍采用 2D 的细胞培养方法，进行生物学的研究，以及进行药物的筛选、开发和疾病治疗的研究。

2 2D 和 3D 细胞培养及对细胞的影响

通常，2D 细胞培养不但被用来在体外研究不同类型的细胞，还被用来进行药物的筛选和评价等各个方面。这种单层的培养体系使细胞生长于聚酯或玻璃的表面，同时存在的培养液能够给细胞生长提供养分。无数的生物学家通过这种方式极大地推动了生物学和医学进展。

然而，其简单的操作方法也造成了这种模式无法准确的描述和模拟细胞在体内复杂的微环境和各种复杂生物学过程，如细胞信号传递，生化过程或几何学改变。另外通过 2D 细胞培养方法获得的数据应用于体内也会造成一些误导和不可预测性。这些原因促使很多科学家将目标转向了 3D 细胞培养技术，一种在体外能够更加准确描述细胞真实微环境的方法。细胞在体外三维环境下生长产生特殊的生物物理和生物力学信号，这些都会影响到细胞的功能，如细胞迁移、细胞粘附、增殖和基因表达等 ( 如下图 )。

我们知道，有多种不同的 3D 细胞培养方法，不同的方法有着各自的优点和缺点。与 2D 培养不同，3D 细胞培养具有微小结构的形成和复杂的环境特征，能够促进细胞的分化和组织形成。实际上，相比较于生长于 2D 环境，在 3D 环境中细胞能够承受更多的形态学和生理学变化。有研究发现，细胞基底的成分和结构不但能够影响基因表达，还能增强细胞间联系。如有些促进细胞增值的基因在 3D 培养环境下受到抑制，从而不会像 2D 培养下那样无限生长。3D 细胞培养还会促进共培养环境下的两种不同细胞群体的生长，从而能够准确重现组织功能。另外，3D 培养技术能够使细胞微环境参数 ( 温度、化合物浓度、氧气、pH 等 ) 易于控制和监测。

但是 3D 细胞培养技术也有明显的缺陷，这些缺陷还需要技术进步来弥补。首先，一些基质胶会从动物或其他来源吸收一些有害或不需要的物质，如病毒，可溶性因子等，会干扰细胞培养。有些基质具有很好的细胞粘附性，使细胞去除过程更加困难。 另外，3D 细胞培养技术是一种高性价比的技术，能够在药物评价阶段省掉动物药物测试过程，整个流程可实现自动化，可重复性好。

3 3D 细胞技术的延伸和前景

随着 3D 细胞培养技术的发展和成熟，大量的新的相关技术出现，如微流控技术、微器官技术等。这些技术使得培养环境的控制和监测更加容易，同时能够使药物推进临床的速度大大加快，评价结果的可靠性也会大大增加。

二、3D 细胞球培养方法

根据 3D 细胞培养中细胞生长情况，分为两种方法，基于 Scaffold 基质胶的 (SCAFFOLD-BASED) 3D 细胞培养法和无基质(SCAFFOLD-FREE) 的 3D 细胞培养。

1 基质的类型

基质是3D细胞培养的重要成分，根据不同的培养条件和目的，选择不同的基质。

2 基于 Scaffold 基质胶的 (SCAFFOLD-BASED) 3D 细胞培养法

基质为细胞培养中的细胞提供支撑。细胞能够增殖并迁移进入基质网络内部，终粘附到基质上。当细胞生长时，成熟细胞相互影响，并终形成接近于细胞来源组织的微型结构。在大部分情况下，这些细胞会表现为尺寸各异的球形，称为细胞球：这些细胞结构通常用于药物筛选、评价或者其他 3D 细胞的应用。通常，有基质支撑的 3D 细胞培养方法获得的细胞球，由于基质提供了较大的接触面积，其大小会比没有基质支撑的方法获得的细胞球更大。

2.1 基质的种类和成分

根据培养的细胞类型的不同，基质蛋白纤维的特性和形状应与之相配合。基质蛋白纤维的布局应与模拟的器官结构相符，具有类似的结构、尺度和功能。然而，基质纤维越大、结构越复杂，就越难以提取。另外，为了防止任何可能出现的障碍 ( 免疫反应、纤维化、影响生长 )，无论采用何种类型的基质，所采用的基质都必须为细胞生长提供支撑，并具有生物相容性。基质可以是水凝胶，薄膜 ( 或者管状 )，和 3D 基质结构。

2.2 水凝胶基质

凝胶具有很好的力学特征，是常用的基质。它具有类似于组织的刚性，在某种程度上能够很好地模拟细胞外基质的作用。事实上，就像其他的基质，凝胶这种空洞结构就像一个能够保持营养物质和可溶性因子 ( 如细胞因子、生长因子 ) 的细胞外基质，这些可溶性因子由细胞产生，在凝胶种扩散，使细胞通过非直接接触的方式进行通讯联系。通过这种方法，非常适合于进行微型细胞实体组织的模拟，并在此基础上进行药物的毒性检测和评价等。

包含大量水和天然生物分子 ( 藻酸盐、明胶、透明质酸、琼脂糖、层粘连蛋白、纤维蛋白 ) 都可作为基质。但是其凝胶化基质比较复杂，会使制备和操作非常困难。

合成的和天然的生物聚合物也可作为 3D 培养的凝胶。根据实验条件和终目的，可找到多种不同的聚合物，包括惰性的和可生物降解的。聚合物易于操作，更适合于构建基质。

其他类型基质：除了水凝胶外，还有很多基质材料可用。非凝胶聚合材料基质常用于组织工程，不同的材料都需要符合所要模拟器官的机械和物理学特征。

3 无基质 (SCAFFOLD-FREE) 的 3D 细胞培养

要形成细胞球，细胞团块即可作为一种很好的生理模块而无需依赖于固体物质的支持。这样获得的细胞球通常比较小，也相对松散。主要的 scaffold-free 3D 细胞培养法就是 forced-floating ( 强制浮动法 ), hanging drop ( 悬滴法 ) 和 agitation based( 搅动法 )。

forced-floating ( 强制浮动法 ) 是用*低粘附的聚合物包被的多孔板来进行。通过向孔内加入细胞悬液后进行离心获得。

悬滴法是通过将含有细胞的液滴处理，使细胞聚集为紧凑的均一的细胞球。

agitation based ( 搅动法 ) 使用生物反应器获得三维的细胞球结构。