细菌RNA提取试剂盒（DNase I）说明书

RNApure Bacteria Kit（DNase I）

细菌RNA提取试剂盒（DNase I）

Cat. No.   K0539

保存：DNase I、10×Reaction Buffer：-20℃

其它组分：室  温

组分说明

                                              Cat. No.              k0539

                                              Kit Size                 50

                                              DNase I                1000 U

                                        10×Reaction Buffer           1000  μl

                                             Buffer RL               35 ml

                                            Buffer RW1               40 ml

                                    Buffer RW2（concentrate）          11 ml

                                        RNase-Free Water             10 ml

                                      Shredder Spin column             50

                                         Spin Column RM               50

                                    Collection Tube（1.5 ml）            50

                                     Collection Tube（2 ml）            100

产品简介

    本试剂盒采用高效、专一结合核酸的离心吸附柱和*的缓冲系统，可从细菌或培养的动物细胞中快速提取总 RNA。30-40 分钟内即可完成反应，提取的总 RNA 纯度*，没有蛋白质和其他污染，适用于 RT-PCR、Real-Time RT-PCR、芯片分析、体外翻译等实验。

注意事项

1.  预防RNase污染，应注意以下几方面：

1）使用无RNase的塑料制品和枪头，避免交叉污染。

2）玻璃器皿应在使用前于180℃高温下干烤4小时，塑料器皿可在0.5 M NaOH中浸泡10分钟，用水*冲洗后高压灭菌。

3）配制溶液应使用无RNase的水。

4）操作人员戴一次性口罩和手套，实验过程中要勤换手套。

2.  Buffer  RL 在使用前请加入β-巯基乙醇至终浓度为 1%，如 1 ml Buffer  RL 加 10 μl  β-巯基乙醇。加入β-巯基乙醇的

Buffer RL 4℃可保存 1 个月，如出现沉淀，请加热溶解后使用。

3.  第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明先在 Buffer RW2 中加入无水乙醇。

5.  如未特殊说明，所有离心步骤均在室温下进行，且所有操作步骤动作要迅速。

自备试剂：Lysozyme（YJ0887）、β-巯基乙醇、无水乙醇（新开封或提取RNA专用）  

操作步骤

 1.   4℃  10,000 rpm（~13,400×g）离心2分钟收集菌体（菌体量最大不超过1×10⁹ ），小心去除所有上清。

     注意：上清如果有残留，会影响后续的消化过程。

 2.   用含有Lysozyme的100  μl TE缓冲液*重悬菌体，室温孵育。具体配方和孵育时间如下：

TE 缓冲液中 Lysozyme 的终浓度                孵育时间

G 细菌                  400  μg/ml                 3-5 分钟

                          -

G+ 细菌                 3 mg/ml                   5-10 分钟

 3.   加入350  μl裂解液RL（使用前请检查是否加入β-巯基乙醇），涡旋震荡混匀（此步骤可能出现不溶性沉淀），将溶液与沉淀全部加入到已装入收集管（Collection Tube 2 ml）的过滤柱（Shredder Spin Column）中，10,000 rpm离心 2分钟。

 4.   向上步得到的滤液中加入250  μl无水乙醇，混匀（此时可能会出现沉淀）。将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱（Spin Column RM）中（吸附柱已装入2 ml收集管中），10,000 rpm离心1分钟，弃掉废液，将吸附柱重新放回收集管中。

 5.   向吸附柱中加入350  μl Buffer RW1，10,000 rpm离心1分钟，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中。

 6.   配制DNase I  混合液：取52 μl RNase-Free Water，向其中加入8  μl 10×Reaction Buffer 和20  μl DNase I（1U/μl），混匀，  配制成终体积为80 μl的反应液。

 7.   向吸附柱中直接加入80 µl DNase I  混合液，20-30℃孵育15分钟。

 8.   向吸附柱中加入350  μl Buffer RW1，10,000 rpm离心1分钟，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中。

 9.   向吸附柱中加入500  μl Buffer RW2（使用前检查是否加入无水乙醇）, 10,000 rpm离心1分钟,弃废液。

 10. 重复步骤9。

 11. 将吸附柱放回收集管中，10,000 rpm离心2分钟。

     注意：这一步的目的是将吸附柱中残余乙醇去除，乙醇残留会影响后续的酶促反应(酶切、PCR等)。

 12. 将吸附柱装入新的RNase-Free的1.5 ml  收集管中，向吸附膜的中间加入30-50 μl RNase-Free Water，室温放置1分钟，10,000 rpm离心1分钟，收集RNA溶液，-70℃保存RNA，防止降解。

注意：1）  RNase-Free Water 体积不应小于 30 μl，体积过小影响回收率。

2）  如果要提高RNA的产量，可用30-50 μl新的RNase-Free Water重复步骤12。

3）  如果要提高RNA浓度，可将得到的溶液重新加入到吸附柱中，重复步骤12。

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