病毒RNA提取试剂盒说明书

RNApure Virus Kit

目录号：K0586

运输条件：室温（15-25℃）。

保存条件：室温（15-25℃）。

组分说明

                    Size                            50

                    Buffer RLV                     15 ml

                    Buffer RW1                     40 ml

                    Buffer RW2（concentrate）        11 ml

                    Proteinase K                  12.5 mg

                    Proteinase K Storage Buffer   1.25 ml

                    RNase-Free Water               10 ml

                    Spin Column RS                  50

                    Collection Tube（1.5 ml）         50

                    Collection Tube（2 ml）           50

              本产品仅供科研使用，请勿用于临床诊断及其他用途  

产品简介

　　本试剂盒采用可以特异性结合病毒 RNA的吸附柱和*的缓冲液系统，适用于从血清、血浆、尿液、脑脊液等无细胞体液及细胞培养上清液中分离病毒RNA。病毒RNA特异性地结合到硅基质膜上，而污染物则流过该膜。通过两次高效洗涤*去除蛋白质等杂质，然后用无RNase的水或试剂盒提供的RNase-Free  Water洗脱高纯度的病毒RNA。由本试剂盒提取的病毒RNA可直接用于RT-PCR、Real-time  RT-PCR和印迹分析等实验。

自备试剂：无水乙醇，0.9% NaCl。

实验前准备及重要注意事项

1．向Proteinase K中加入1.25 ml Proteinase K Storage Buffer使其溶解，-20℃保存。配制好的Proteinase  K勿长时间室温放置，避免反复冻融，以免影响其活性。

2．预防RNase污染，应注意以下几方面：

   1）使用无RNase的塑料制品和枪头，避免交叉污染。

   2）玻璃器皿应在使用前于180℃高温下干烤4小时，塑料器皿可在0.5 M NaOH中浸泡10分钟，用水*冲洗后高压灭菌。

   3）配制溶液应使用无RNase的水。

   4）操作人员戴一次性口罩和手套，实验过程中要勤换手套。

3．血清或血浆避免反复冻融导致蛋白变性或产生沉淀，减少病毒滴度进而影响提取病毒核酸的产量。

4．第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明先在Buffer RW2中加入无水乙醇。

5．Buffer RLV如果产生沉淀，可在56℃加热使其溶解后室温放置。

6．所有离心步骤若无特殊说明均在室温下进行，且所有操作步骤动作要迅速。

操作步骤

1．室温下取200 μl血清或血浆加到1.5 ml离心管（自备）中。

   注意：不足200 μl可以加入0.9 % NaCl（客户自备）补足。

2．向上步溶液中加入20 μl Proteinase K，混匀。

3．加入200 μl Buffer RLV，涡旋震荡15秒。

   注意：不要直接把Proteinase K加到Buffer RLV中。

4．56℃孵育15分钟，短暂离心，将管壁上的溶液收集到管底。

5．加入250 μl无水乙醇，涡旋震荡15秒，室温孵育5分钟，短暂离心，将管壁上的溶液收集到管底。

6．将步骤5得溶液全部加入到已装入收集管（Collection  Tube 2  ml）的吸附柱（Spin Column RS）中，若一次不能将全部溶液加入吸附柱中，请分两次转入，8,000 rpm（~6000 ×g）离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

7．向吸附柱中加入500 μl Buffer RW1，8,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

8．向吸附柱中加入500 μl Buffer RW2（使用前检查是否加入无水乙醇），8,000  rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

9．向吸附柱中加入500 μl无水乙醇，8,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

10.12,000 rpm (~13,400×g)离心3分钟，倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟，以*晾干。

   注意：1）这一步的目的是将吸附柱中残余乙醇去除，乙醇的残留会影响后续的酶促反应（酶切、PCR等）。

   2）推荐步骤：将吸附柱放入一个新的1.5 ml离心管（自备）中，打开管盖，56℃烘箱孵育3分钟，使吸附柱的膜*干燥。

11.将吸附柱置于一个新的无RNase离心管（Collection Tube 1.5  ml）中，向吸附柱的中间部位悬空加入20-50 μl RNase-Free Water，室温放置5分钟，12,000 rpm离心1分钟，收集RNA溶液，-70℃保存RNA，防止降解。

   注意：1）RNase-Free Water体积不应小于20 μl，体积过小影响回收率。

   2）如果要提高RNA的产量，可用20-50 μl新的RNase-Free Water重复步骤11。

   3）如果要提高RNA浓度，可将得到的溶液重新加入到吸附柱中，重复步骤11。

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