[操作步骤] 1、 加样：分别设标准孔、待测样品孔、空白孔。设标准孔7孔，依次加入100μL不同浓度的标准品(见试剂准备2)。空白孔加100μL(见试剂准备第二步后一管)，余孔加待测样品100μL，酶标板加上覆膜，37oC温育2小时。

2、 弃去液体，甩干，不用洗涤。

3、 每孔加检测溶液A工作液100μL(临用前配制)，酶标板加上覆膜，37oC温育1小时。

4、 弃去孔内液体，每孔用350μL的洗涤液洗涤，浸泡1-2分钟，吸去(不可触及板壁)或甩掉酶标板内的液体，在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次(也可轻拍将孔内液体拍干)，重复洗板3次。后一次洗涤后，要把孔内的洗涤液*甩干。自动洗板机亦可。

5、 每孔加检测溶液B工作液(临用前配制)100μL，加上覆膜，37oC温育30分钟。

6、 弃去孔内液体，甩干，洗板5次，方法同步骤4。

7、 每孔加底物溶液90μL，酶标板加上覆膜，37oC避光显色(反应时间控制在15-25分钟，不要超过30分钟。当标准孔的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔梯度不明显时，即可终止)。

8、 每孔加终止溶液50μL，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。如出现颜色不匀一，请轻轻晃动酶标板以使溶液混合均匀。

9、 在确保酶标板底无水滴及孔内无气泡后，立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度(O.D.值)。