逆转录-聚合酶链反应 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR) 的原理是：提取组织或细胞中的总 RNA，以其中的 mRNA 作为模板，采用 Oligo（dT） 或随机引物利用逆转录酶反转录成 cDNA。再以 cDNA 为模板进行 PCR 扩增，而获得目的 基因或检测基因表达。RT-PCR 使 RNA 检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量 RNA 样品分析成为可能。

一、反转录酶的选择

1． Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA 酶 H 活性相对 较弱。最适作用温度为 37℃。

2．禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和 RNA 酶 H 活性。最适作用 温度为 42℃。

3．Thermus thermophilus、Thermus flavus 等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在 Mn2+存在下，允许高温反转录 RNA，以消除 RNA 模板的二级结构。

4．MMLV 反转录酶的 RNase H-突变体：商品名为 Superscript 和 SuperScriptⅡ。此种 酶较其它酶能多将更大部分的 RNA 转换成 cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反 转录很困难的 mRNA 模板合成较长 cDNA。

二、合成 cDNA 引物的选择

1． 随机六聚体引物：当特定 mRNA 由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长 mRNA。用此种方法时，体 系中所有 RNA 分子全部充当了 cDNA 第一链模板，PCR 引物在扩增过程中赋予所需要的 特异性。通常用此引物合成的 cDNA 中 96%来源于 rRNA。

2． Oligo(dT)：是一种对 mRNA 特异的方法。因绝大多数真核细胞 mRNA 具有 3’端 Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅 mRNA 可被转录。由于 Poly(A+)RNA 仅占总 RNA 的 1-4%，故此种引物合成的 cDNA 比随机六聚体作为引物和得到的 cDNA 在数量和复杂性 方面均要小。

3． 特异性引物：最特异的引发方法是用含目标 RNA 的互补序列的寡核苷酸作为引物， 若 PCR 反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与 mRNA 3’端最靠近的配对引物起 始。用此类引物仅产生所需要的 cDNA，导致更为特异的 PCR 扩增。