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双抗体夹心法检测抗原的操作步骤及灵敏度提高方法

时间:2024-12-17      阅读:31

双抗体夹心法检测抗原的操作步骤:

1包被抗体:将特异性抗体(捕获抗体)包被在固相载体(如酶标板)表面,通常在 4℃ 过夜,使抗体通过物理吸附固定在固相表面。

2封闭:用封闭液(如 1% - 5% 的牛血清白蛋白溶液)封闭固相载体表面未被抗体占据的位点,以减少后续检测中的非特异性结合。在 37℃ 孵育 1 - 2 小时。

3加样:将待测样品加入到已包被和封闭好的固相载体孔中,在 37℃ 孵育一定时间,使样品中的抗原与固相载体上的捕获抗体结合。

4洗涤:用洗涤液洗去未结合的物质,重复多次以确保洗干净。

5加检测抗体(酶标抗体):加入酶标记的特异性抗体(检测抗体),该抗体能识别结合在捕获抗体上的抗原的另一个表位。在 37℃ 孵育一定时间,使检测抗体与抗原结合,形成“捕获抗体 - 抗原 - 酶标检测抗体”复合物。

6洗涤:再次用洗涤液洗去未结合的酶标检测抗体。

7显色:加入酶的底物溶液,孵育一段时间,酶催化底物产生显色反应。

8终止反应:加入终止液终止显色反应。

9结果测定:使用酶标仪在特定波长下测定各孔的吸光度值。根据标准曲线计算出样品中抗原的含量。

需要注意的是,实际操作中应根据具体的试剂盒说明书进行优化和调整。

 

提高双抗体夹心法的检测灵敏度方法:

1优化抗体:选择亲和力高、特异性强的优质抗体,以增强对抗原的结合能力。

2增加抗体的包被量:在固相载体上包被更多的捕获抗体,有助于捕获更多的抗原。

3改进包被条件:如优化包被缓冲液的 pH 值、离子强度等,以提高抗体与固相载体的结合效率和稳定性。

4延长孵育时间:使抗原与抗体有更充分的结合机会。

5提高酶的标记效率:使用更高效的标记方法或选择活性更高的酶标记检测抗体,以增强显色信号。

6优化显色系统:选择更灵敏的显色底物,或者改进显色条件(如温度、时间等)。

7样本前处理:对样本进行适当的浓缩、纯化等前处理步骤,以提高抗原的浓度。

8降低检测背景:通过更严格的洗涤步骤,减少非特异性结合导致的背景信号。

9采用信号放大技术:例如使用生物素 - 亲和素系统等方法来放大检测信号。


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