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c3h10t1/2细胞，鼠间充质细胞株 （细胞培养中常见的生物污染类型有7种，分别是细菌污染、支原体污染、原虫污染、黑胶虫污染、真菌污染、病毒污染以及非细胞污染，那么他们污染细胞的特点分别是什么呢？怎样能够减少污染现象的发生？）

1-细菌

细菌污染常见的有大肠杆菌，葡萄球菌等。细菌污染较易发现，在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，培养液一般会在短时间内变黄，有时静置的培养液不混，稍加震荡会有很多混浊物漂起。显微镜下可见培养液中有大量圆球状颗粒物漂浮，有时在细胞表面及周围有大量细菌存在，细胞停止生长并有中毒表现。

处理：①在培养液中加入相应的抗生素，能够预防绝大多数的细菌污染。

2-真菌

真菌污染是细胞培养过程中zui常见的一种，尤其梅雨季节快要到了，进行细胞培养时更易污染。污染细胞的多为烟曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等。霉菌污染后多数在培养液中形成白色或浅黄色漂浮物。一般肉眼可见，较易被发现，短期内培养液多不混浊，倒置显微镜下可见于细胞之间纵横交错穿行的丝状、管状、及树枝状菌丝，并悬浮飘荡在培养液中。

很多菌丝在高倍镜可见到有链状排列的菌珠；念珠菌或酵母菌形态呈卵形，散在细胞周边和细胞之间生长。镜下看时，要将培养瓶用酒精棉球擦干净，以防止与瓶外尤其瓶底外面生长的菌丝相混淆。

真菌污染后，细胞生长变慢，但zui后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。真菌生长的比较慢，不象细菌那么容易被发现，但是一旦发现有它的存在细胞就被污染了，也很难救活了。

3-支原体

支原体的大小介于细菌和病毒之间，是一种独立生活的微生物。对热敏感，对一般抗生素不敏感。支原体的形态多变，多吸附在细胞表面和细胞之间。电镜下观察，中心有高密度的密集颗粒，横断面与细胞微绒毛相似。

因国内的血清大多数都没有做支原体阴性检测，而支原体又是牛血清中zui常见的微生物之一。支原体污染细胞后，培养液轻微发生混浊．但细胞变化不显著，随着细胞的培养会慢慢死亡。

支原体污染检测（荧光染色法）：DNA和与DNA特异性结合的荧光染料结合，使得支原体的DNA着色，然后用荧光显微镜观察。镜下支原体为散在于细胞同围或附于细胞膜表面的亮绿色小点。

解决：

1）抗生素排除法：支原体污染预防比解决好。如果不小心污染后，可加入高浓度抗生素（常规使用的5倍浓度）作用24-48小时，再换入常规培养液，但该法不保证有效。推荐用量：庆大霉素 200μg/ml ,四环素10μg/ml ，卡那霉素50μg/ml 。

2）加温除菌：支原体不耐热，可以对支原体污染的细胞热处理除菌。因高温对细胞本身也会产生一定影响，故热处理前需先进行预实验，确定对细胞影响zui小而能zui大程度的杀死支原体的时间。

4-黑胶虫

黑胶虫的存在目前尚有争议，其在低倍下为黑色点状，高倍下可看见黑色的小虫游来游去，培养液也是不浑的，对细胞生长状态不会有明显影响，在细胞增殖旺盛之后会自然消失，除更换血清外无须特殊处理。

5-原虫

培养液可轻微浑浊，显微镜下那些细小的点状物数量非常多，轻微活动，细胞虽然可以生长但繁殖速度却明显减慢，而且细胞状态不好，边缘不清楚，细胞不透亮。他们与细胞可共生但会与细胞争夺营养。这种共生是非常普遍的，但他们的数量小，细胞站优势所以不会影响到细胞的正常生长，只有当他们到达一定的数量时就会影响到细胞的生长，zui终形成恶性循环。

6-病毒

组织细胞培养过程中，如果没有除去潜在的病毒，就会产生病毒污染。目前，从原代猴肾细胞的培养中已发现不少于20种血清性病毒。 尽管病毒污染的细胞不影响原代培养，但生产疫苗是不安全的。因此，潜在病毒是细胞大量生产和疫苗、干扰素等生物制品制作中的难题。

7-非同种细胞污染

即细胞交叉污染，由于细胞培养操作时各细胞株所需的器材和溶液没有严格分开，往往会使一种细胞被另一种细胞污染。目前，世界上已有几十种细胞都被HeLa细胞所污染，致使许多实验宣告无效。非细胞培养物所造成的化学成分的污染也偶有发生，大多是由于细胞培养所需物品清洗消毒不*而带入一些有毒化学物质所致。

污染是细胞培养的大敌，预防和避免污染是成功培养细胞的关键之一。危机意识要贯彻实验的始终，否则不仅浪费时间，而且浪费人力、物力，甚至造成无法弥补的损失。

  （如何预防细胞培养的污染和清除这些污染物呢？）慧颖 细胞库 技术为您解答：

一、污染的预防

预防是防止细胞培养过程中发生污染的办法。只有预防工作做在前，才能将发生污染的可能性降到zui小程度。一般预防可从以下几方面着手：

1-从操作者做起

1操作者责任心要强，要细心稳重，操作技术要熟练。进无菌室前要用肥皂洗手或用5%新洁尔灭浸泡5分钟，按规定穿隔离衣。进入后关好门，坐下来尽量少走动。工作开始要先用75%酒精棉球擦手、擦瓶口和烧灼瓶口。事先要严格检查器材、溶液和培养物，不要把污染品或未经消毒的物品带入无菌室内，更不能随便使用，以免造成大批污染。

2、操作者动作要轻，必须在火焰周围无菌区内打开瓶口，并将瓶口转动烧灼。操作时尽量不要谈话，若打喷嚏或咳嗽应转向背面。

3、操作时要常更换吸管，切勿一根吸管做到底。一旦发现吸管口接触了手和其他污染物品应弃去。实验完毕及时收拾，保持实验室清洁整齐，zui后用消毒水浸泡的纱布擦台面。

2-从物品、用品消毒灭菌着手

细胞培养所用物品清洗、消毒要*，各种溶液灭菌除菌要仔细，并在无菌试验阴性后才能使用。操作室及剩余的无菌器材要定期清洁消毒灭菌。

3-防止细胞交叉污染

在进行多种细胞培养操作时，所用器具要严格区分，做上标记便于辨别。并按顺序进行操作，避免一起进行时易发生混乱。

在进行换液或传代操作时，注射器和滴管不要触及细胞培养瓶瓶口，以免把细胞带到培养液中污染其他细胞。

所有细胞一旦购置，或从别处引入，或自己建立，均应及早留种冻存，一旦发生污染可弃之复苏，重新培养。

二、污染的清除

培养细胞一经污染，多数较难处理。如果污染细胞价值不大，宜弃之；有细胞株留存的或可购置的，可在寻找原因后*消毒操作室，复苏或重新购置细胞，再培养。若污染细胞价值较大，又难于重新得到，可采取以下办法清除。

1-使用抗生素

抗生素对杀灭细菌较有效。联合用药比单独用药效果好。预防用药比污染后再用药效果好。预防用药一般用双抗生素（青霉素100u/mL加链霉素100μg/mL），污染后清除用药需采用大于常用量5～10倍的冲洗法，于加药后作用24～48小时，再换常规培养液。此法在污染早期可能有效。所用抗生素品种除青霉素、链霉素外，还可用庆大霉素、卡那霉素、多粘菌素、四环素、制霉菌素等。常用400～800μg/mL卡那霉素或200μg/mL四环素处理，每隔2～3日换液1次，传1～2代进行治疗。近年来有报道，4-氟，2-羟基喹啉（Ciprofloxacin,Cip）、截耳素衍生物（Pleu-romutilinderivative,BM-Cyclin2:BM-1和四环素衍生物（BM-2）等三种抗生素单用或合用对杀灭支原体有效。这三种抗生素均用PBS配成250浓缩液，-20℃保存备用，使用浓度Cip为10μg/mL，BM-1为10μg/mL，BM-2为5μg/mL。使用时先吸除污染的培养液，加入含BM-1的RPMI1640培养液，3天后再吸除培养液，加入含BM-2的RPMI1640培养液，培养4天，如此连续3个轮次，直至用33258荧光染色镜检证明已清除支原体后，再加正常培养液培养传代3-4次。

2-使用支原体特异性血清

用5%的兔支原体免疫血清（血凝效价1:320以上）可去除支原体污染，因特异抗体可抑制支原体生长，故经抗血清处理后11天即转为阴性，并且5个月后仍为阴性。但此法比较麻烦，不如用抗生素方便、经济。

3-加温处理

将污染的组织培养物放在41℃培养18小时，可杀死支原体，但对细胞有不良影响。所以在处理前要进行预试验，摸索能zui大限度杀死支原体又对细胞影响zui小的加热时间。此法有时不可靠。若先用药物处理后，再以41℃加温处理效果更佳。

4-其他方法

除了上述去除污染的方法外，还有动物体内接种除菌法、巨噬细胞吞噬法、污染培养瓶中加溴尿嘧啶再用光照射的方法及过滤法等，但均较麻烦，且效果不确定。所以一旦支原体污染，除非有特别重要价值，一般均弃之重新培养。

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