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面议NobleRyder FQ-PCR05-1 染料法qPCRMix 2× Universal SYBR qPCR Master Mix 1mL
产品品牌：NobleRyder
产品货号：FQ-PCR05-1
产品名称：染料法qPCRMix
英文名称：2× Universal SYBR qPCR Master Mix
产品规格：1mL
NobleRyder 染料法qPCRMix
产品内容：
组分 | FQ-PCR05-1 | FQ-PCR05-5 |
2× Universal SYBR qPCR Master Mix | 1 mL | 4×1.25 mL |
DNase-free Water | 1 mL | 4×1.25 mL |
产品简介
2× Universal SYBR qPCR Master Mix是使用SYBR Green I 嵌合荧光法进行qPCR的2×试剂。主要成分包括化学修饰的Hot Start Fast Taq DNA Polymerase、dNTP、Mg2+、SYBR Green I和针对qPCR优化的最适Buffer。本产品可在宽广的定量区域内获得良好的标准曲线，实验结果重复性好、可信度高。另外，预混液体系中添加了特殊ROX Reference Dye，适用于不同qPCR 仪器，配置反应体系时只需加入引物和模板即可扩增。
注意事项
1. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
2. 请于使用前确保产品wan全解冻，彻di混匀后短暂离心，置于冰上备用。
3. 反复冻融会影响产品性能。如每次用量较少，推荐小份分装使用。
4. 本产品中含荧光染料SYBR Green I，使用中应尽量避免强光照射。
实验流程
配制检测试剂
1. 按照下表配置PCR反应体系（注：配置多个反应孔时，请为各组分预留10%的余量，以免移液损失。）
试剂组份 | 20μL体系 | 50μL体系 |
2× Universal SYBR qPCR Master Mix | 10 μL | 25μL |
Forward Primer (10μM) | 0.4 μL* | 1μL* |
Reverse Primer (10μM) | 0.4 μL* | 1μL* |
模板DNA/cDNA | X μL* | X μL* |
DNase-free Water | As required | As required |
Total Volume | Up to 20 μL | Up to 50 μL |
*通常每条引物终浓度为0.2 μM，也可根据情况在0.1~0.4μM 间进行调整。
*微量体积加样时误差大，建议模板稀释后再加入反应体系中，这样可以有效提高实验的重复性；如模板类型为未稀释cDNA原液，使用体积不应超过qPCR反应总体积的 1/10。
2. 反应体系配好后，盖好反应盖，充分涡旋混匀，离心，避免产生气泡。
反应程序设置
标准程序
Stage | 步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |
Stage 1 | 预变性/酶激活* | 95 ℃ | 5 min | 1 |
Stage 2 | 变性 | 95 ℃ | 15 sec | 40 |
退火/延伸/采集信号* | 60 ℃ | 40 sec* | ||
Stage 3 | 熔解曲线* | 仪器默认程序 | 1 | |
快速程序
Stage 1 | 步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |
Stage 1 | 预变性/酶激活* | 95 ℃ | 5 min | 1 |
Stage 2 | 变性 | 95 ℃ | 2 sec | 40 |
退火/延伸/采集信号* | 60 ℃ | 20 sec* | ||
Stage 3 | 熔解曲线* | 仪器默认程序 | 1 | |
*延伸时间请根据您使用的Real Time qPCR仪数据采集最短时间限制以及PCR产物长度自行调整。
*模板拷贝数较低时采用标准程序可提高数据的重现性。
结果分析
定量检测至少需要三个生物学重复，反应结束后需要确认扩增曲线的线形，熔解曲线的峰形。
1. 扩增曲线：标准扩增曲线为S型。
Ct值小于10，需要将模板稀释后，重新进行实验（每稀释一倍，Ct值增大1）；
Ct值30-35之间时，需要提高模板浓度，或者增大反应体系的体积，以提高扩增效率，保证结果分析的准确性；
Ct值大于35时，检测结果不可信。
2. 熔解曲线：
熔解曲线单峰，表明反应特异性好可以进行定量结果分析；若熔解曲线出现明显双峰或者多峰，则不能进行定量分析，需要重新设计引物。
常见问题与解决方案
►扩增曲线形状异常
①扩增曲线不光滑：使用的八联排管或PCR板可能与设备不匹配，设备光源可能松动。
②扩增曲线突然骤降：反应管内留有气泡，样本离心后仔细检查反应管内是否有气泡残留。
►反应结束无扩增曲线出现
①循环数不够：一般设置为40个循环。
②确认程序中是否设置了信号采集步骤。
③确认引物、模板是否降解。
►阴性对照出现扩增
①反应体系污染：更换新的Mix、水、引物重复实验。在超净工作台进行反应体系配置，减少气溶胶污染。
②产生引物二聚体，配合溶解曲线进行分析。
③使用含UDG/dUTP 防污染体系的扩增试剂。
►实验重复性差
①加样体积失准：建议使用大体积加样以减少误差。
②模板浓度太低：模板浓度越低，重复性越差，减少模板稀释倍数或增加模板体积。
③反应体系未充分混匀：上机检测前将反应体系充分混匀后再离心。
产品订购信息：
NobleRyder FQ-PCR05-1 染料法qPCRMix 2× Universal SYBR qPCR Master Mix 1mL
NobleRyder FQ-PCR05-5 染料法qPCRMix 2× Universal SYBR qPCR Master Mix 5mL
NobleRyder FQ-PCR06-1 染料法qPCRMix 2× miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix 1mL
NobleRyder FQ-PCR06-5 染料法qPCRMix 2× miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix 5mL
NobleRyder FQ-PCR07-1 染料法qPCRMix 2x Blue Universal SYBR qPCR Master Mix 1mL
NobleRyder FQ-PCR07-5 染料法qPCRMix 2× Blue Universal SYBR qPCR Master Mix 5mL
NobleRyder 染料法qPCRMix
