DNA专题：DNA纯化实验
时间：2013-07-22 阅读：1662
| 实验方法原理 | 本试剂盒适合从各种琼脂糖凝胶中提取多至 8 μg DNA（70 bp-10 Kb），回收率为 60-85%。琼脂糖凝胶在温和的缓冲液（DE-A 溶液）中溶解，其中的保护剂能防止线状 DNA 在高温下降解，然后在 DE-B 溶液的作用下使 DNA 选择性结合到膜上。纯化的 DNA 纯度高，并保持片断完整性和高生物活性，可直接用于连接、体外转录、PCR 扩增、测序、微注射等分子生物学实验。 |
|---|---|
| 实验材料 | PCR产物 单链DNA 质粒DNA |
| 试剂、试剂盒 | DNA凝胶回收试剂盒 |
| 仪器、耗材 | DNA 制备管 离心管 |
| 实验步骤 | 一、试剂盒组成、贮存、稳定性 1. 说明书，耗材：DNA 制备管、2 ml 离心管、1.5 ml 离心管。 2. Buffer DE-A：凝胶熔化剂，含 DNA 保护剂，防止 DNA 在高温下降解。室温密闭贮存。 3. Buffer DE-B：结合液（促使大于 70 bp 的 DNA 片段选择性结合到 DNA 制备膜上）。室温密闭贮存。若出现沉淀，应于 70°C 温育溶解并冷却至室温后再使用。 4. Buffer W1：洗涤液，室温密闭贮存。 5. Buffer W2 concentrate：去盐液，使用前，根据瓶上数量加入乙醇，混合均匀，室温密闭贮存。可用 100%无水乙醇或 95%乙醇。 6. Eluent：2.5 mM Tris-HCl，pH 8.5，室温密闭贮存。 二、实验准备 1. *次使用前，Buffer W2 concentrate中加入体积的无水乙醇。 2. 准备无核酸和核酸酶污染的Tip头、离心管。 3. 准备75°C水浴。 三、操作步骤 1. 在紫外灯下切下含有目的 DNA 的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎。计算凝胶重量（提前记录 1.5 ml 离心管重量），该重量作为一个凝胶体积（如 100 mg = 100 μl 体积）。 2. 加入 3 个凝胶体积的 Buffer DE-A，混合均匀后于 75°C 加热（低熔点琼脂糖凝胶于 40°C 加热），间断混合（每 2-3 min），直至凝胶块*熔化（约 6-8 min）。 3. 加 0.5 个 Buffer DE-A 体积的 Buffer DE-B，混合均匀；当分离的 DNA 片段小于 400 bp 时，加入 1个凝胶体积的异丙醇。 步骤 4-6 可以选择负压法或离心法。 A. 负压法 4A. 正确连接负压装置，将 DNA 制备管插到负压装置的插口上。吸取步骤 3 中的混合液，转移到制备管中，开启并调节负压至-20-30 英寸汞柱，缓慢吸走管中溶液。 . 加 0.5 ml Buffer W1，吸尽管中溶液。 6A. 加 0.7 ml Buffer W2，吸尽管中溶液。以同样的方法再用 0.7 ml Buffer W2 洗涤一次。 * 确认在 Buffer W2 concentrate 中已按试剂瓶上的体积加入无水乙醇。 B. 离心法 4B. 吸取 3 中的混合液，转移到 DNA 制备管（置于 2 ml 离心管）中，12 000×g 离心 1 min。弃滤液。 5B. 将制备管置回离心管，加 0.5 ml Buffer W1，12 000×g 离心 30 s，弃滤液。 6B. 将制备管置回离心管，加 0.7 ml Buffer W2，12 000×g 离心 30 s，弃滤液。（可选步骤）以同样的方法再用 0.7 ml Buffer W2 洗涤一次 12,000×g 离心 1 min。 * 确认在 Buffer W2 concentrate 中已按试剂瓶上的体积加入无水乙醇。 7. 将制备管置于 2 ml 离心管中，12 000×g 离心 1 min。 8. 将制备管置于洁净的 1.5 ml 离心管中，在 DNA 制备膜正中央加 25-30 μl 水或 Eluent，室温静置1 min。12 000×g 离心 1 min 洗脱 DNA。 |
| 注意事项 | 1. 在步骤 1 中，将凝胶切成细小的碎块可大大缩短凝胶熔化时间（线型 DNA 长时间暴露在高温条件下易于水解），从而提高回收率。勿将含 DNA 的凝胶长时间地暴露在紫外灯下，减少紫外线对 DNA造成的损伤。 2. 在步骤 2 中凝胶必须*熔化，否则将严重影响 DNA 回收率。 3. 将 Eluent 或水加热至 65°C，有利于提高洗脱效率。 4. DNA 分子呈酸性，建议在 2.5 mM Tris-HCl |