DNA专题：血基因组DNA提取实验
时间：2013-07-22 阅读：1661
血基因组DNA提取可以：（1）从冻全血、血浆、血清、骨髓、其他体液、淋巴细胞、培养细胞、病毒和线粒体中提取DNA；（2）用于后续测序、遗传信息学等研究。
实验方法
- 血基因组DNA 试剂盒提取法
- 血基因组DNA大量试剂盒提取法
- 血基因组DNA中量试剂盒提取法
| 实验方法原理 | 本试剂盒采用*的两相分离技术，结合DNA制备膜选择性地吸附DNA的方法达到纯化基因组DNA的目的。适合从3ml的抗凝人或哺乳动物全血获得100 μg的基因组DNA，抗凝鸟类或两栖动物全血中获得多至120 μg的基因组DNA。 |
|---|---|
| 实验材料 | 抗凝全血 |
| 试剂、试剂盒 | 血基因组DNA中量试剂盒 |
| 仪器、耗材 | 中量制备管 中量滤器 连接管 塑料扳手 中量管盖 |
| 实验步骤 | 一、试剂盒组成、贮存、稳定性 说明书，耗材：中量制备管、中量滤器、连接管、塑料扳手、中量管盖。 Buffer VL：细胞和病毒裂解液，室温密闭贮存。 Buffer G-B：蛋白沉淀液，室温密闭贮存。 Buffer DV-A：Buffer DV 的制备液，请参照实验准备Buffer DV 的配制方法配制，室温密闭贮存。 Buffer DV：相分离液，室温密闭贮存。 Buffer BV：DNA 结合液，室温密闭贮存。 Buffer W1：洗涤液，室温密闭贮存。 Buffer W2 concentrate：去盐液。使用前，根据瓶上数量加入乙醇，混合均匀，室温密闭贮存。可用100%乙醇或95%乙醇。 Eluent：2.5 mM Tris-HCl，pH 8.5，室温密闭贮存。 二、实验准备 1. *次使用时，在Buffer W2 concentrate 中按试剂瓶上的体积加入无水乙醇。 2. 准备无核酸和核酸酶污染的Tip 头、离心管。 3. 制备Buffer DV：取2 ml Buffer DV-A 125 ml 异丙醇，75 ml 异丁醇，加入提供的250 ml 试剂瓶中，混合均匀。 4. 4℃预冷Buffer DV。 三、操作步骤 【DNA 释放 】 1. 将3 ml 抗凝全血加入一50 ml 离心管中，若全血样本体积不足3 ml，用PBS 补充至3 ml。 2. 加入6 ml Buffer VL，盖紧离心管帽，旋涡振荡1 min。 3. 加入6 ml Buffer G-B，再次盖紧离心管帽，立刻上下混匀。 【两相分离去除蛋白和其它杂质】 4. 加入12 ml Buffer DV（4℃预冷），用力混合均匀。≥5 000×g 离心5 min。 * 请在实验前按实验准备中提供的方法准备Buffer DV。 5. 尽可能吸尽蓝色上相，保留相间沉淀和下相。加入12 ml，4℃预冷Buffer DV，用力混合，≥5 000×g 离心5 min。 【基因组DNA 的纯化】 6. 丢弃上相，将下相转移至中量滤器中（滤器置于另一50 ml 离心管中），将活塞插入注射器，缓慢推动活塞，收集50 ml 离心管中的滤液。 * 上相必须*弃尽。 * 如在转移过程中下相没有任何界面沉淀，步骤6 可以省略。 7. 弃滤器，在滤液中加入6 ml Buffer BV，混合均匀。 8. 将连结管插到负压装置的插口上，再将DNA 中量制备管插到连结管上。将步骤7 的混合液移到制备管中，开启并调节负压装置至-20-30 英寸汞柱，吸尽管中液体。 9. 保持负压，加入8 ml Buffer W1，吸尽管中液体。 10. 保持负压，加入9 ml 已加入乙醇的Buffer W2，吸尽管中液体。 * 确认在Buffer W2 concentrate 中已按试剂瓶上的体积加入无水乙醇。 11. 用塑料扳手将中量制备管中的DNA 结合部分从负压装置转移至另一洁净的1.5 ml 离心管中，加入0.3 ml Buffer W2，盖上中量制备管盖后，12 000×g 离心2 min。 12. 将DNA 结合部分置于另一洁净的1.5 ml 离心管中，在silica 膜中央加0.5 ml Eluent 或去离子水，盖上中量制备管盖后，室温静置2 min，12 000×g 离心1 min 洗脱DNA。 * 将去离子水或Eluent 加热至65℃将提高洗脱效率。 13. 可选步骤：同样方法，在silica 膜中央加0.25 ml Eluent 或去离子水，盖上中量制备管盖后，室温静置1 min，12 000×g 离心1 min 洗脱DNA。 |
| 注意事项 | 1. Buffer VL，Buffer BV 和Buffer W1 含刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套和眼镜，避免沾染皮肤、眼睛和衣服，谨防吸入口鼻。若沾染皮肤、眼睛时，要立即用大量清水和生理盐水冲洗，必要时寻求医疗咨询。 2. 在按照此说明书操作前，请确保已做好足够的对血传播病毒的防护工作，按照正确方法处理体液和感染源。 3. 操作时严格按操作步骤进行，废物必须放入含消毒液的废物缸，并高压灭菌 |