问题图1（模板中有碱基缺失，往往是单一位点（1-1）或两个位点（1-2）碱基缺失导致测序结果移码）

图1-1


图1-2

 

解决方法：将PCR 产物克隆到质粒（如T 载体）中挑单克隆测序，或将PCR 产物进行PAGE纯化（至少琼脂糖充分电泳后切胶纯化）后再进行测序。问题图2（PCR 产物不纯，含部分序列一致的两种以上的片段，长度不一）

图2

 

解决方法：主要原因是PCR 产物没有纯化，含有部分序列一致的两种以上长度不一的片段，将PCR 产物进行PAGE 纯化（至少琼脂糖充分电泳后切胶纯化）后再进行测序，便可解决。

 

问题图3（测序引物有碱基缺失）

 

测序引物有碱基缺失（一般是引物的5'端缺失），和模板的碱基缺失即图1 有些类似，所不同的是模板碱基缺失一般是在一段正常测序序列后才出现移码，而引物碱基缺失的话，则从测序一开始就出现移码，表面在图形上便是一开始就是严重的峰形重叠。

解决方法：重新合成引物，或将引物进行PAGE 纯化（注：好多公司虽然称提供的引物为PAGE级，但是，嘿嘿……）

2、克隆测序时出现峰形重叠

原因：所挑选的重组子不是单克隆，所提供的测序用质粒中含有两种以上插入片段不同的质粒；或是是送测序的菌液污染。
 

解决方法：重新挑单克隆的菌落（划线分离单菌落），提质粒或送菌液再次测序。

3、样品有杂合/突变位点

模板中有杂合型突变，也就说模板本身在这个位点出现突变；或者是从基因组中扩增出来的杂合位点。如果模板有杂合（突变或缺失），那么测序图形中其他的位點一般都是單一的峰形，然后突然在某一個位點出現重叠峰（如图中箭頭所示）。
 

解决方法：建议将DNA 片段克隆到载体再测序。
 

4、polyA/T 和C/G cluster 导致的套峰和测序信号衰减
 

图4-1

图4-2

略（太大无法上传，删除部分图片）

图4-3

图4-4

RACE 测序时经常遇到图4-1 和图4-4 的情形，解决方法：从另一端测序；但如果这样的序列出现在中间，呵呵，目前还没有很好的解决方法，要看测序公司的本事了。C/G cluster 在PrV 基因组测序时遇到过。后来还是让TaKaRa 公司给解决了，虽然不喜欢鬼子，但有时候却不得不用它们的产品和服务。

 

5、基因中含有重复序列

可能的原因: 样品中含有重復序列导致的测序结果和PolyA/T 的结果一样，会导致Frame 滑动，较短的重復序列会导致测序结果出现移码；而较长的重復序列会使定序信号衰减。

解决办法: 反向测序有时能够顺利的通过重復序列区域（但不是一定都能够），通过多次的测序结果比对，拼接可以得到全序列结果。