DNA实验技术：分子克隆的常用载体
时间：2013-10-12 阅读：4208
DNA段的克隆需要合适的载体，载体或是质粒，或是噬菌体，或是病毒，通常大多经过人工改造[地的。作为载体必须具备两条件：一是该载体在细胞内必须能自主复制，即必须具备复制原点；二是该载体必须具备适合的酶切位点，且这些酶切位点不在复制原点区域内。以上两条，保证了载体的可繁殖性和可利用性。为了便于获得阳隆克隆，载体上常有筛选标记，如对抗菌素的抗性，某些基因产物的显色反应等。
一、质粒
常用的有pBR322，pUC系列质粒等。
（一）pBR322质粒是4362bp的环状双链DNA载体，有2个抗药性基因（四环素和氨苄青霉素），一个复制起始点和多个用于克隆 的限制酶切点。当缺失抗药性基因的大肠杆菌被pBR322成功地转化时，它便从该质粒获得了抗生素抗性。两个抗生素基因中均含供插入外源DNA用的不同的单一酶切位点。一般只选一个抗生素基因作为插入外源DNA之用。外源DNA插入后该抗生素抗性失活。另一抗生素抗性基因则作为转化细菌后筛选阳性克隆 之用。
（二）pUC系列质粒是2.7Kb的双链DNA质粒，有一个复制起点，一个氨苄青霉素抗性基因和一个多克隆位点，多克隆位点处于表达LacZ基因产物-β-半乳糖苷酶的氨基端片段，用pUC质粒转化LacZ基因有突变的大肠杆菌株（M15）时，因为由质粒表达的α－肽补充了大肠杆菌却失的α－肽，所以恢复了分解半乳糖的能力。在加入IPTG和X-gal的培养基上，长出蓝色克隆。如果在多克隆位点内插入外源DNA，由于它破坏了α－肽的表达，因而在加入IPTG和X－gal的培养基，不能长出蓝色克隆，这就是所谓的蓝白筛选。
二、单链丝状噬菌体和噬粒
（一）大肠杆菌丝状噬菌体包括M13噬菌体f噬菌体等，其基因组 均是单链闭环DNA分子，其中M13mp系列克隆载体是对野生型M13加以改造，插入了多克隆位点和LacZ基因后的载体，所以也是可以利用IPTG和X-gal作蓝白筛选的，M13感染大肠杆菌后，即在菌体内酶的作用下，以感染性单链DNA（正链）为模板，转变为双链DNA，称作复制型DNA（RF DNA）。一般当每一个细胞内有100-200个RF DNA拷贝时，即停止复制，产生有感染性的完整的单链丝状噬菌体并分泌离开菌体。感染M13的大肠杆菌可继续生长，并不发生裂解，但生长速度则较正常菌慢，取感染M13的细菌培养液离心，即可从菌体中提取RF DNA，供限制酶切割等分子克隆操作之用；从离心后的上清液中，可用聚乙二醇（PEG）沉出噬菌体颗粒，提取单链DNA（ss DNA）供DNA序列分析，体外定位突变等使用。
（二）噬粒（phagemid）在质粒DNA中插入一段单链噬菌体的复制起始点DNA，即构成了噬粒，如pGEM-3Zf（-）就是一种噬粒。噬粒可像一般质粒一样操作，但当需要制备单链DNA时，就需要在培养时加入辅助噬菌体，常用的辅助噬菌体有M13KO7和R408。培养好的菌液在离心除去菌体后，上清中加入PEG即可沉出含有单链DNA的颗粒。噬粒也常用于DNA序列分析和体外定位突变。分子克隆常用载体除了上述两类以外，还有 噬菌体和粘粒，详细情况可参阅有关资料。