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细胞色素C氧化酶（COX）ELISA 试剂盒

碱性磷酸酶

系从小牛肠粘膜和大肠杆菌中提取，由多个同功酶组成。它们的底物种类很多，常用者为硝基苯磷酸盐，廉价无毒性。酶解产物呈黄色，可溶，大吸收值在400nm。酶的活性以在pH10反应系统中，37℃1分钟水解1μg磷酸苯二钠为一个单位。

细胞色素C氧化酶（COX）ELISA 试剂盒

定量测定

ELISA操作步骤复杂，影响反应因素较多，特别是固相载体的包被难达到各个体之间的*，因此在定量测定中，每批测试均须用一系列不同浓度的参考标准品在相同的条件下制作标准曲线。测定大分子量物质的夹心法ELISA，标准曲线的范围一般较宽，曲线高点的吸光度可接近2.0，绘制时常用半对数值，以检测物的浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，将各浓度的值逐点连接，所得曲线一般呈S形，其头、尾部曲线趋于平坦，中央较呈直线的部分是理想的检测区域。

测定小分子量物质常用竞争法，其标准曲线中吸光度与受检物质的浓度呈负相关。标准曲线的形状因试剂盒所用模式的差别而略有不同。ELISA测定的标准曲线注意图中横坐标为对数关系，这更有利于测定系统的表达。

操作程序

1.   分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准品孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品孔中加入标准品50μl；在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品zui终稀释度为5倍）。每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。轻轻晃动混匀，37℃温育60分钟。

2.   弃去液体，甩干，每孔加满稀释后洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。如此重复5次，拍干。

3.   每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.

4.   取出酶标板，每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

5.   测定：以空白孔调零，在450nm波长下测量各孔的吸光度值（OD值）。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。

6.   根据标准品的浓度及对应的OD值计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样品的OD值在回归方程上计算出对应的样品浓度。也可以使用各种应用软件来计算。应记住由于样品稀释了的，其实际浓度应该乘以总稀释倍数。

亲和素是一种糖蛋白，一分子亲和素可以与四个生物素小分子发生专一亲和作用，类似抗原与抗体亲和。它们之间的作用力是目前已知强的非共价作用。80年代后，随着生物素-亲合素系统（BAS）作用被发现，这一亲和作用被结合应用到ELISA技术上，大大提高了后者反应的灵敏性与专一性。生物素很易与蛋白质（如抗体等）以共价键结合。这样，结合了酶的亲和素分子与结合有特异性抗体的生物素分子产生反应，既起到了多级放大作用，又由于酶在遇到相应底物时的催化作用而呈色，达到检测未知抗原（或抗体）分子的目的。