现代液相色谱中，分离效果好坏的一个重要指标是色谱填料的选择。但是色谱填料的选择范围很宽，因此，要做合适的选择，必须对此有一定的认识和了解。
    一、硅胶基质填料 
    1、正相色谱。正相色谱用的固定相通常为硅胶（Silica）以及其他具有极性官能团胺基团，如（NH2，APS）和氰基团（CN，CPS）的键合相填料。
    由于硅胶表面的硅羟基（SiOH）或其他极性基团极性较强，因此，分离的次序是依据样品中各组分的极性大小，即极性较弱的组份zui先被冲洗出色谱柱。正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低，如正已烷（Hexane），氯仿（Chloroform），二氯甲烷（Methylene Chloride）等。
    2、反向色谱。反向色谱用的填料常是以硅胶为基质，表面键合有极性相对较弱官能团的键合相。反向色谱所使用的流动相极性较强，通常为水、缓冲液与甲醇、乙腈等的混合物。样品流出色谱柱的顺序是极性较强的组分zui先被冲洗出，而极性弱的组分会在色谱柱上有更强的保留。
    常用的反向填料有：C18（ODS）、C8（MOS）、C4（Butyl）、C6H5（Phenyl）等。
    二、聚合物填料。聚合物填料多为聚苯乙烯—二乙烯基苯或聚甲基丙烯酸脂等，其重要优点是在PH值为1—14均可使用。相对于硅胶基质的C18填料，这类填料具有更强的疏水性；大孔的聚合物对蛋白质等样品的分离非常有效。现有的聚合物填料的缺点是相对硅胶基质填料，色谱柱柱效较低。
    三、其它无机填料。其它HPLC的无机填料色谱柱也已经商品化由于其特殊的性质，一般于特殊的用途。如，石墨化碳黑正逐渐成为反向色谱柱填料。这种填料的分离不同于硅胶基质烷基键合相，石墨化碳的表面即是保留的基础，不再需其它的表面改性。该柱填料一般比烷基键合相硅胶或多孔聚合物填料的保留能力更强。石墨化碳可用于分离某些几何异构体，由于在HPLC流动相中不会被溶解，这类柱可在任何PH与温度下使用。氧化铝也可以用于HPLC。氧化铝微粒刚性强，可制成稳定的色谱柱柱床，其优点是可以在PH高达12的流动相中使用。但由于氧化铝与碱性化合物的作用也很强，应用范围受到一定限制，所以未能广泛应用。新型色谱氧化锆基质填料也可用于HPLC。商品化的只有聚合物涂层的多孔氧化锆微球色谱柱，应用PH1-14，温度可达100℃。由于氧化锆填料是zui近几年才开始研究，加之面临的实验难度，其重要用途与优势尚在进行之中。
    怎样选择填料粒度。目前，商品化的色谱填料粒度从1um到超过30um均有销售，而目前分析分离主要用3和5um填料进行。填料的粒度主要影响填充柱的两个参数，即柱效和背压。粒度越小，柱压越大，柱压的增加限制了粒度小于3um的填料应用。在相同选择性条件下，提高柱效可提高分离度，但不是*的因素。如果固定相选择是正确，但是分离度不够，那么选用更小的粒度的填料是很有用的。3um填料填充柱的柱效比相同条件下的5um填料的柱效提高近30%；然而，3um的色谱柱的背压却是5um的2倍。与此同时，柱效提高意味着在相同条件下可以选用更短的色谱柱，即相同的塔板数或分离能力，但是柱长更短，以缩短分析时间。另外，可以采用低粘度的溶剂做流动相或增加色谱柱的使用温度，比如用乙腈代替甲醇，以降低色谱柱的压力。 

色谱柱维护 
（1）防止色谱柱堵塞 
原因1：溶剂中的不溶物 
 — 应使用色谱纯溶剂，膜过滤（孔径不超过0.45μm） 
原因2：样品中的不溶物 
 — 应对样品进行膜过滤（孔径不超过0.45μm） 
原因3：泵，进样器等中的不溶物 
—  在泵和进样器之间安装内置过滤器，在进样器和柱之间安装预过滤器 
原因4：柱内不溶物的形成 
4-1．由于溶剂的不互溶而产生的沉淀 
—用能溶解沉淀物的溶剂冲洗色谱柱 
4-2．在不互溶溶剂中由于进样而产生的沉淀 
    —检查样品液和流动相是否互溶 
4-3．由于温度的改变或固定相的干涸而产生的沉淀 
—将色谱柱密封紧，并保持室温恒定 
操作压力上升故障排除 
HPLC系统流程图： 
吸入过滤器>>泵>>内置过滤器>>进样器>>预过滤器>>保护柱>>主分析柱>>检测器 
和排放系统 
从流程图的末端依次断开部件，如从检测器开始断开，zui容易引起阻塞的部件是： 
预过滤器，保护柱和主分析柱 。
[注]：应记录新柱子在常规分析条件下的操作压力 
（2）柱堵塞的修复 
步骤1：使用含盐缓冲液后（如离子对试剂）应用溶解性强的溶剂（如水）进行冲 
洗 ；
步骤2：先断开检测器，然后用对来自样品中的物质有强溶解性的溶剂进行冲洗。 
对于反相色谱柱，可使用甲醇，乙睛，四氢呋喃，氯仿，庚烷等，在此条件下，应 
避免溶剂的pH低于2或高于8；
若经过步骤1和步骤2后，压力仍没下降至步骤3 ；
步骤3：断开检测器，将色谱柱反方向放置，然后检查柱压 
1）若压力稳定下降，至步骤4 

2）若压力不下降，至步骤5 
步骤4：保持色谱柱反方向连接，用低于0.5 ml/min 流速冲洗1小时 
若步骤4不能降压，至步骤5 ；
步骤5：若内置过滤器被堵塞，应冲洗或更换。柱连接端的拆卸或重装会导致柱效 
下降，（有效塔板数下降和不对称峰），若步骤5不能降低柱压，至步骤6 
步骤6：若进口端的填料发生堵塞，柱子将不可能被*恢复，只能通过去掉进口 
端的部分填料，重新填充进行有限的柱效恢复。（2~5mm） ；
[注]：在多数情况下，柱效将严重地下降 
步骤7：若步骤6无法改善柱子性能，那么柱子已无法修复，请注意当拆开连接端时 
柱子已不再得到质量保证。 
柱效的下降：
导致柱有效塔板数和分离能力下降的主要原因是固定相的恶化和硅胶表面活性链的 
损失，在这些条件下柱子已不可能再恢复

色谱柱的使用

1、色谱柱的使用说明： 
　　（1）色谱柱使用前注意事项：色谱柱的储存液无特殊说明，均为评价报告所示的流动相。在使用前，一定要注意色谱柱的储存液与要分析样品的流动相是否互溶。在反相色谱中，如用高浓度的盐或缓冲液作洗脱剂，应先用10％左右的低浓度的有机相洗脱剂过渡一下，否则缓冲液中的盐在高浓度的有机相中很容易析出，堵塞色谱柱。
　　（2）流动相：流动相中所使用的各种有机溶剂要尽可能使用色谱纯，配流动相的水是超纯水或全玻璃器皿的双蒸水。如果将所配得流动相再经过0.45μm的滤膜过滤一次则zui好，尤其是含盐的流动相。另外，装流动相的容器和色谱系统中的在线过滤器等装置应该定期清洗或更换。
　　以常规硅胶为基质的键合相填料通常的PH值适用范围是2.0-8.0，BDS C18适合于碱性化合物，PH值适用范围为2.0-10.0。当必须要在PH值适用范围的边界条件下使用色谱柱时，每次使用结束后立即用适合于色谱柱储存并与所使用的流动相互溶的溶剂清洗，并*置换掉原来所使用的流动相。
　　（3）样品：样品也要尽可能清洁，可选用样品过滤器或样品预处理柱（SPE）对样品进行预处理；若样品不便处理，要使用保护柱。在用正相色谱法分析样品时，所有的溶剂和样品应严格脱水。
　　2、色谱柱的保存 
　　（1）反相色谱柱每天实验后的保养：使用缓冲液或含盐的流动相，实验完成后应用10%的甲醇/水冲洗30分钟，洗掉色谱柱中的盐，再用甲醇冲洗30分钟。注意：不能用纯水冲洗柱子，应该在水中加入10%的甲醇，防止将填料冲塌陷。
　　（2）长期保存色谱柱：如色谱柱要长时间保存，必须存于合适的溶剂下。对于反相柱可以储存于纯甲醇或乙腈中，正相柱可以储存于严格脱水后的纯正己烷中，离子交换柱可以储存于水（含防腐剂*或柳硫汞）中，并将购买新色谱柱时附送的堵头堵上。储存的温度是室温。
　　3、色谱柱的再生 
　　因为色谱柱是消耗品，随着使用时间或进样次数的增加，会出现色谱峰高降低，峰宽加大或出现肩峰的现象，一般来说可能是柱效下降。
　　（1）反相柱的再生：依次采用20-30倍的色谱柱体积的甲醇：水=10：90 （V/V），乙腈，异丙醇作为流动相冲洗色谱柱，完成后再以相反顺序冲洗色谱柱。
　　（2）正相柱的再生：依次以20-30倍色谱柱的体积的正己烷、异丙醇、二氯甲烷、甲醇作为流动相冲洗色谱柱，然后再以相反的顺序冲洗色谱柱。要注意上述溶剂必须严格脱水。
　　4、色谱柱在使用过程中易出现的问题和解决办法 
　　色谱柱在使用中zui常见的问题就是柱压升高，如果柱压是在长时间使用过程中缓慢增加，属于正常现象。但柱压在使用过程中突然升高（系统管路堵塞及压力传感器故障除外），以下列举了部分常见原因及解决办法：
　　（1）色谱柱头的过滤筛板堵塞或污染；
　　解决方法：如确定是色谱柱头的过滤筛板被污染，可以将色谱柱反方向用甲醇冲洗至正常压力，或者卸下色谱柱头，将其放在10％的稀硝酸内超声清洗10分钟，后再用纯水超声10分钟，重新装入色谱柱。
　　（2）色谱柱头的填料被样品污染；
　　解决方法：如确定色谱柱头的填料被污染，将柱头螺丝卸下，挖出柱内前段被污染的填料，用相同的柱填料重新填入，仔细修复后，重新安装上柱头螺丝。
　　（3）色谱柱内缓冲液中的盐遇到高浓度的甲醇或其他有机溶剂，形成结晶析出； 解决方法：如确定定是盐结晶，用10%的甲醇/水冲洗色谱柱使柱内盐全部溶解，再换高浓度甲醇。
　　（4）流动相PH值过大或过小使固定相结构破坏或溶解。解决方法：如果因PH值使用不当，很难恢复 液相色谱仪由高压液体泵、检测器及液相色谱柱等三部分组成，其中液相色谱柱的正确安装和使用，是液相色谱工作的关键；也是液相色谱工作者获得正确可靠的实验数据的必经之路。
　　一、液相色谱柱的安装：
　　1、液相色谱柱的结构：
　　a、空柱由柱接头、柱管及滤片组装而成。
　　柱接头采用低死体积结构，柱接头是两端螺纹组件，一端是为7/16英寸外螺纹，另一端是3/16英寸的内螺纹(国内外已规范化)。7/16英寸外螺纹与1/4英寸柱管(Φ6.35mm)连接，中间放置压坏用于密封。3/16英寸的内螺纹与1/16英寸(Φ1.57mm)的连接管连接，中间也放置压环用于柱接头的密封。为了尽量减少柱外死体积，在安装色谱柱时，用Φ1.57mm连接管通过空心螺钉压环后要尽量插到底，然后再拧紧空心螺钉。压环被空心螺钉挤压变形后紧箍在连接管上(连接管通过压环后露出的管长度应严格控制在2．5mm长或其他固定尺寸)。
　　在两端柱接头内，柱管两端各放置一片不锈钢滤片(或滤网)，用于封堵柱填料不被流动相冲出柱外而流失。空柱各组件均为316#不锈钢材质，能耐受一般的溶剂作用。但由于含氯化物的溶剂对其有一定的腐蚀性，故使用时要注意，柱及连接管内不能长时间存留此类溶剂，以避免腐蚀。
　　b、柱填料：
　　液相色谱柱的分离作用是在填料与流动相之间进行的，柱子的分类是依据填料类型而定。
　　正相柱：多以硅胶为柱填料。根据外型可分无定型和球型两种，其颗粒直径在3—10
μm的范围内。另一类正相填料是硅胶表面键合—CN，-NH2等官能团即所谓的键合相硅胶。
　　反相柱：主要是以硅胶为基质，在其表面键合十八烷基官能团(ODS)的非极性填料。也有无定型和球型之分。
　　常用的其他的反相填料还有键合C8、C4、C2、苯基等，其颗粒粒径在3—10 μm之间。
　　2、色谱柱的安装：
　　a、拆开柱包装盒，确认色谱柱的类型、尺寸、出厂日期以及柱内贮存的溶剂。
　　b、拧下柱两端接头的密封堵头放回包装盒供备用。
　　c、 按柱管上标示的流动相流向，将色谱柱的入口端通过连接管与进样阀出口相连接(如条件允许，建议在柱前使用保护柱)；柱的出口与检测器连接。连接管是外径为1.57mm、内径为0.1-0.3mm的不锈钢管。连接管的两端均有空心螺钉及密封用压环。在接管时一定要设法降低柱外死体积。连接管通过空心螺钉、压环后尽量用力插到底，然后顺时针拧紧空心螺钉，直到拧不动为止，再用扳手继续顺时针拧1/4-1/2圈，切记不要用力过大。如色谱柱通过流动相加压后有漏液现象，请用扳手继续顺时针拧1/4圈，直至不漏液为止。
　　二、液相色谱柱的使用：
　　色谱柱在使用前，进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同；另外，在做柱性能测试时是按照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用的条件是*条件)，只有这样，测得的结果才有可比性。
　　1、样品的前处理：
　　a、使用流动相溶解样品。
　　b、使用予处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。
　　c、使用0.45μm的过滤膜过滤除去微粒杂质。
　　2、流动相的配制：
　　液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的，因此要求流动相具备以下的特点：
　　a、流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中(或长时间保留在柱中)。
　　b、流动相具有一定惰性，与样品不产生化学反应(特殊情况除外)。
　　c、流动相的黏度要尽量小，以便在使用较长的分析柱时能得到好的分离效果；同时降低柱压降，延长液体泵的使用寿命(可运用提高温度的方法降低流动相的黏度)。
　　d、流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用UV检测器，使用对紫外吸收较低的溶剂配制。
　　e、流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行。
　　f、在流动相配制好后，一定要进行脱气。除去溶解在流动相中的微量气体既有利于检测，还可以防止流动相中的微量氧与样品发生作用。
　　3、流动相流速的选择：
　　因柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可得到不同的柱效。对于一根特定的色谱柱，要追求*柱效，使用*流速。对内径为4.6mm的色谱柱，流速一般选择1ml/min，对于内径为4.0mm柱，流速0.8ml/min为佳。
　　当选用*流速时，分析时间可能延长。可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间(如使用反相柱时，可适当增加甲醇或乙腈的含量)。
　　注意：
　　a．由于甲醇廉价，对于反相柱推荐使用甲醇体系(必须使用乙腈的场合除外)。
　　b．对于正相柱推荐使用沸程为30-60℃的石油醚或提纯后的己烷作流动相，没有提纯的己烷不得使用。用水使用超纯水(电阻率大于18兆欧)，去离子水及双蒸水中含有酚类杂质，有可能影响分析结果。
　　c．含水流动相zui奸在实验前配制，尤其是夏天使用缓冲溶液作为流动相不要隔夜。加入*，防止细菌生长。
　　d．流动相要求使用0.45 μm滤膜过滤，除去微粒杂质。
　　e．使用HPLC级溶剂配制流动相，使用合适的流动相可延长色谱柱的使用寿命，提高柱性能。
　　4、柱性能测试：
　　启动液相色谱仪：a、流动相流速设定为1ml/min。
　　b、UV检测器波长设定为254nm。
　　使用出厂测试时使用的流动相组成及测试样品。
　　记录并计算测试结果。

2、色谱柱的保存 

（1）反相色谱柱每天实验后的保养：

使用缓冲液或含盐的流动相，实验完成后应用10%的甲醇/水冲洗30分钟，洗掉色谱柱中的盐，再用甲醇冲洗30分钟。注意：不能用纯水冲洗柱子，应该在水中加入10%的甲醇，防止将填料冲塌陷。

（2）长期保存色谱柱：

如色谱柱要长时间保存，必须存于合适的溶剂下。对于反相柱可以储存于纯甲醇或乙腈中，正相柱可以储存于严格脱水后的纯正己烷中，离子交换柱可以储存于水（含防腐剂*或柳硫汞）中，并将购买新色谱柱时附送的堵头堵上。储存的温度是室温。

3、色谱柱的再生  

因为色谱柱是消耗品，随着使用时间或进样次数的增加，会出现色谱峰高降低，峰宽加大或出现肩峰的现象，一般来说可能是柱效下降。

（1）、反相柱的再生：依次采用20-30倍的色谱柱体积的甲醇：水=10：90 （V/V），乙腈，异丙醇作为流动相冲洗色谱柱，完成后再以相反顺序冲洗色谱柱。

（2）、正相柱的再生：依次以20-30倍色谱柱的体积的正己烷、异丙醇、二氯甲烷、甲醇作为流动相冲洗色谱柱，然后再以相反的顺序冲洗色谱柱。要注意上述溶剂必须严格脱水。

4、色谱柱在使用过程中易出现的问题和解决办法 

色谱柱在使用中zui常见的问题就是柱压升高，如果柱压是在长时间使用过程中缓慢增加，属于正常现象。但柱压在使用过程中突然升高（系统管路堵塞及压力传感器故障除外），可能的原因有如下几点：

（1）色谱柱头的过滤筛板堵塞或污染；

（2）色谱柱头的填料被样品污染；

（3）色谱柱内缓冲液中的盐遇到高浓度的甲醇或其他有机溶剂，形成结晶析出；

（4）流动相PH值过大或过小使固定相结构破坏或溶解。

解决办法如下：

（1）如确定是色谱柱头的过滤筛板被污染，可以将色谱柱反方向用甲醇冲洗至正常压力，或者卸下色谱柱头，将其放在10％的稀硝酸内超声清洗10分钟，后再用纯水超声10分钟，重新装入色谱柱。

（2）如确定色谱柱头的填料被污染，将柱头螺丝卸下，挖出柱内前段被污染的填料，用相同的柱填料重新填入，仔细修复后，重新安装上柱头螺丝。

（3）如确定定是盐结晶，用10%的甲醇/水冲洗色谱柱使柱内盐全部溶解，再换高浓度甲醇。

（4）如果因PH值使用不当，很难恢复。