犬超氧化物歧化酶（SOD）酶联免疫分析方法
时间：2019-10-15 阅读：1188
<p>犬超氧化物歧化酶（SOD）酶联免疫分析（ELISA）<br />
试剂盒使用说明书<br />
本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定犬血清，血浆及相关<br />
液体样本中超氧化物歧化酶（SOD）的活性。<br />
实验原理：<br />
本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中犬超氧化物歧化酶（SOD）水平。用纯化的抗- SOD<br />
抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入超氧化物歧化酶（SOD），<br />
再与HRP 标记的SOD 抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过*洗涤后加底物<br />
TMB 显色。TMB 在HRP 酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成终的黄色。颜<br />
色的深浅和样品中的超氧化物歧化酶呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD<br />
值），通过标准曲线计算样品中犬超氧化物歧化酶（SOD）浓度。<br />
试剂盒组成：<br />
试剂盒组成48 孔配置96 孔配置保存<br />
说明书1 份1 份<br />
封板膜2 片（48） 2 片（96）<br />
密封袋1 个1 个<br />
酶标包被板1×48 1×96 2-8℃保存<br />
标准品：180U/mL 0.5ml×1 瓶0.5ml×1 瓶2-8℃保存<br />
标准品稀释液1.5ml×1 瓶1.5ml×1 瓶2-8℃保存<br />
酶标试剂3 ml×1 瓶6 ml×1 瓶2-8℃保存<br />
样品稀释液3 ml×1 瓶6 ml×1 瓶2-8℃保存<br />
显色剂A 液3 ml×1 瓶6 ml×1 瓶2-8℃保存<br />
显色剂B 液3 ml×1 瓶6 ml×1 瓶2-8℃保存<br />
终止液3ml×1 瓶6ml×1 瓶2-8℃保存<br />
浓缩洗涤液（20ml×20 倍）×1 瓶（20ml×30 倍）×1 瓶2-8℃保存<br />
样本处理及要求：<br />
1. 血清：室温血液自然凝固10-20 分钟，离心20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上<br />
清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。<br />
2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA 或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20 分钟后，离心<br />
20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次<br />
离心。<br />
3. 尿液：用无菌管收集，离心20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清，保存过程<br />
中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。<br />
4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20 分钟左右（2000-3000 转/<br />
分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞<br />
浓度达到100 万/ml 左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20 分<br />
钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。<br />
2<br />
5. 组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备<br />
用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器<br />
将标本匀浆充分。离心20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清。分装后一份待<br />
检测，其余冷冻备用。<br />
6. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上<br />
进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融.<br />
7. 不能检测含NaN3 的样品，因NaN3 抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。<br />
操作步骤<br />
1. 标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10 孔，、第二孔中分别加标<br />
准品100μl，然后在、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从孔、第二<br />
孔中各取100μl 分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，<br />
混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl 弃掉，再各取50μl 分别加到第五、第六孔<br />
中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各<br />
取50μl 分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混<br />
匀后从第七、第八孔中分别取50μl 加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准<br />
品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl 弃掉。（稀释后各孔加样量都为50μl，<br />
浓度分别为120U/mL，80U/mL ，40U/mL，20U/mL， 10U/mL）。<br />
2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样<br />
品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样<br />
品终稀释度为5 倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混<br />
匀。<br />
3. 温育：用封板膜封板后置37℃温育30 分钟。<br />
4. 配液：将30（48T 的20 倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T 的20 倍）倍稀释后备用。<br />
5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 秒后弃去，如此<br />
重复5 次，拍干。<br />
6. 加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。<br />
7. 温育：操作同3。<br />
8. 洗涤：操作同5。<br />
9. 显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色<br />
15 分钟.<br />
10. 终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。<br />
11. 测定：以空白空调零，450nm 波长依序测量各孔的吸光度（OD 值）。测定应在加终止<br />
液后15 分钟以内进行。<br />
注意事项：<br />
1． 试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30 分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未<br />
用完，板条应装入密封袋中保存。<br />
2． 浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。<br />
3． 各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间<br />
控制在5 分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。<br />
4． 请每次测定的同时做标准曲线，做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本OD 值<br />
大于标准品孔孔的OD 值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n 倍）后再测定，计<br />
算时请后乘以总稀释倍数（×n×5）。<br />
5． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。<br />
6． 底物请避光保存。<br />
3<br />
7． 严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.<br />
8． 所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。<br />
9． 本试剂不同批号组分不得混用。<br />
10. 如与英文说明书有异，以英文说明书为准。<br />
计算：<br />
以标准物的浓度为横坐标，OD 值为纵坐标，<br />
在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD<br />
值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释<br />
倍数；或用标准物的浓度与OD 值计算出标<br />
准曲线的直线回归方程式，将样品的OD 值<br />
代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释<br />
倍数，即为样品的实际浓度。<br />
（此图仅供参考）<br />
试剂盒性能：<br />
1.样品线性回归与预期浓度相关系数R 值为0.92 以上。<br />
2.批内与批间应分别小于9%和15%<br />
检测范围：<br />
5U/mL -150U/mL<br />
保存条件及有效期：<br />
1.试剂盒保存：2-8℃。<br />
2．有效期：6 个月</p>