活体细胞溶酶体膜通透性（LMP）/完整性吖啶橙荧光检测试剂盒产品说明书

主要用途

活体细胞溶酶体膜通透性（LMP）/完整性吖啶橙荧光检测试剂是一种旨在通过吖啶橙吸收和细胞内再分布检测技术，选择性地聚集在溶酶体内呈现荧光染色，即存在于或由溶酶体释放到细胞浆的荧光染料的不同荧光强度变化，来分析和观察溶酶体膜通透性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种活体细胞溶酶体（动物、人体、昆虫等）膜通透性的检测。产品严格无菌，即到即用，活体检测，分辨率高，操作简捷，性能稳定。

技术背景

溶酶体（lysosome）是一种动态性的、多态性的、含有水解酶的细胞器，具有接受和降解来自于分泌性、内吞性（endocytic）、自噬性（autophagic）、吞噬性（phagocytic）膜运转通路中的大分子。其功能是膜依赖性，具有解毒和防御作用。溶酶体膜是溶酶体内基质和胞浆之间的生理屏障，为整合性糖蛋白，防止细胞自我降解。一旦溶酶体膜去稳定（destabilization），例如碱性化或内容物移位（translocation），将导致质子和水解酶外漏，而造成细胞器功能异常，进而产生细胞坏死、凋亡，以及病理症状，例如朊病毒脑病（prion encephalopathies）、阿茨罕默病、心肌缺血、脊髓灰质炎病毒感染、补体激活型肺损伤（complement activation-produced lung injury）、急性组织损伤等疾病。其中膜通透性增加，是溶酶体膜去稳定性或去完整性的标志之一，溶酶体内容物大量释放到胞浆中，直接影响细胞的存活。吖啶橙（acridine orange；AO）是一种亲溶酶体（lysomotropic）异染性（metachromatic）的荧光染料，在完整的溶酶体内，为质子化（protonated）寡聚体（oligomeric）形式，呈现红色荧光（激发波长555nm，散发波长617nm），而在胞浆内，为单体去质子化形式，呈现绿色荧光（激发波长490nm，散发波长528nm）。吖啶橙进入溶酶体后重新分布，即吸收和细胞内再分布（uptake and redistribution），用于分析溶酶体膜通透性状况。 

产品内容

清理液（Reagent A）           60毫升

染色液（Reagent B）          100微升

产品说明书   1份

保存方式

保存染色液（Reagent B）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；有效保证6月

用户自备

24孔细胞培养板：用于贴壁细胞染色的容器

1.5毫升离心管：用于细胞染色的容器

微型台式离心机：用于沉淀细胞

培养箱：用于染色孵育

（共聚焦）荧光显微镜：用于细胞荧光分析

荧光分光光度仪或荧光酶标仪：用于细胞荧光定量分析

细胞流式仪：用于细胞荧光分析

实验步骤

一、贴壁细胞染色

1．准备1个细胞培养24孔板的待测细胞（注意：可以使用载玻片，载玻片培养皿，35mm培养皿，和其它培养孔板，见注意事项7）

2．小心抽去细胞培养液

3．小心沿着孔壁加入500微升37℃预热的清理液（Reagent A）到1个细胞培养孔，覆盖培养孔表面

4．小心抽去清理液

5．小心沿着孔壁加入500微升37℃预热的清理液（Reagent A）到1个细胞培养孔，覆盖培养孔表面

6．小心沿着孔壁加入5微升染色液（Reagent B）到1个细胞培养孔，覆盖培养孔表面

7．放进37℃细胞培养箱里孵育15分钟，避免光照

8．小心抽去染色液

9．小心沿着孔壁加入500微升37℃预热的清理液（Reagent A）到细胞培养孔

10．小心抽去清理液

11．重复实验步骤9和10一次

12．小心沿着孔壁加入500微升37℃预热的清理液（Reagent A）到细胞培养孔

13．选择下列方式之一进行操作：

（A）使用倒置荧光显微镜观察（定性检测）：

激发波长555nm，散发波长617nm――红色荧光减弱，表明膜通透性（LMP）增强

（B）使用荧光分光光度仪或荧光酶标仪检测（定量检测）：

激发波长490nm，散发波长528nm――RFU升高，表明膜通透性（LMP）增强

激发波长555nm，散发波长617nm――RFU降低，表明膜通透性（LMP）增强

二、悬浮细胞或脱离细胞染色

1．将悬浮细胞或脱离细胞（1 X 106细胞）移入到1.5毫升离心管

2．放进微型台式离心机离心5分钟，速度为300g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）

3．小心抽去上清液

4．加入500微升37℃预热的清理液（Reagent A），混匀细胞颗粒群

5．放进微型台式离心机离心5分钟，速度为300g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）

6．小心抽去上清液

7．加入500微升37℃预热的清理液（Reagent A），混匀细胞颗粒群

8．加入5微升含有染色液（Reagent B），充分混匀 

9．放进37℃细胞培养箱里孵育15分钟，避免光照

10．放进微型台式离心机离心5分钟，速度为300g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）

11．小心抽去染色液

12．加入500微升37℃预热的清理液（Reagent A），混匀细胞颗粒群

13．放进微型台式离心机离心5分钟，速度为300g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）

14．小心抽去上清液

15．重复实验步骤12至14一次

16．加入500微升37℃预热的清理液（Reagent A），混匀细胞颗粒群

17．选择下列方式之一进行操作：

a)进行细胞流式仪分析：FL1（激发波长488nm，散发波长528nm），或FL3（激发波长555nm，散发波长617nm）观察10000个细胞以上――

FL1：波峰右移，表明膜通透性（LMP）增强

FL3：波峰左移，表明膜通透性（LMP）增强

b)或使用（共聚焦）荧光显微镜观察（定性检测）：

1）移取10微升上述细胞悬液到载波片上，盖上盖玻片 

激发波长555nm，散发波长617nm――红色荧光减弱，表明膜通透性（LMP）增强

c)或使用荧光分光光度仪检测（定量检测）：

1）移取500微升上述细胞悬液到1毫升比色杯

2）加入500微升清理液（Reagent A）

3）上下倾倒混匀数次

4）放进荧光分光光度仪：

激发波长490nm，散发波长528nm――RFU升高，表明膜通透性（LMP）增强

激发波长555nm，散发波长617nm――RFU降低，表明膜通透性（LMP）增强