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组织NADPH细胞色素C还原酶（NADPH Cytochrome C Reductase）活性

比色法定量检测试剂盒产品说明书

主要用途

组织NADPH细胞色素C还原酶（NADPH Cytochrome C Reductase）活性比色法定量检测试剂是一种旨在通过NADPH细胞色素C还原酶反应系统中，细胞色素C还原后峰值的增高，即采用比色法来测定样品中酶活性的而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。其适用于各种组织裂解萃取液样品（动物、人体）或纯化微粒体样品NADPH细胞色素C还原酶的活性检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。

技术背景

NADPH细胞色素C还原酶（NADPH Cytochrome C Reductase；EC1.6.2.4），又称为NADPH细胞色素C还原酶（NADPH-cytochrome P450 reductase；CPR），是一种微粒体（内质网）内电子传导链的黄素蛋白酶，参与药物、脂肪酸、固醇类、外源性化学分子等羟基化代谢作用，启动脂质过氧化作用。通过传递来自NADPH的电子到细胞色素b5或细胞色素P450家系的酶，包括血红素氧合酶等，然后链接到脂肪酸去饱和酶（desaturase）和延伸酶（elongase）通路上。NADPH细胞色素C还原酶存在于所有组织细胞，肝组织高度表达，受到垂体-甲状腺轴调控。NADPH细胞色素C还原酶是内质网的标记蛋白，饮食类脂质和生态污染的生物学标记。基于底物氧化型细胞色素C，在辅酶NADPH的存在下，由NADPH细胞色素C还原酶催化作用，产生还原型细胞色素C，由此出现吸光峰值的变化（550nm波长），来定量测定NADPH细胞色素C还原酶的活性。其反应系统为：

产品内容

清理液（Reagent A）            毫升

裂解液（Reagent B）            毫升

缓冲液（Reagent C）            毫升

反应液（Reagent D）            毫升

底物液（Reagent E）            毫升

阴性液（Reagent F）            毫升

产品说明书   1份

保存方式

保存反应液（Reagent D）和底物液（Reagent E）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；底物液（Reagent E）避免光照；有效保证6月

用户自备

15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器

1.5毫升离心管：用于样品操作的容器

微型台式离心机：用于样品操作

超速离心机：用于样品操作

比色皿或酶标板：用于反应和比色的容器

分光光度仪或酶标仪：用于比色分析

实验步骤

一、样品准备

1.手术取出动物组织，并秤重以确定500毫克组织重量（实验前使动物空腹12至24小时） 

2.（选择步骤）放进预冷的15毫升锥形离心管

3.（选择步骤）加入xx毫升清理液（Reagent A）清洗1次

4.移入一个液氮冻存管

5.即刻放进液氮罐过夜

6.次日从液氮罐里取出，即刻（快速度）碾碎组织成粉末（注意：切莫使组织冻融）

7.放进一个15毫升锥形离心管

8.加入xx毫升预冷的裂解液（Reagent B）

9.涡旋震荡5秒，充分混匀

10.即刻放入预冷的DOUNCE匀浆器

11.在冰槽里用匀浆棒匀化组织（约40下）

12.将所有组织匀浆物移入15毫升锥形离心管

13.放进4℃超速离心机离心30分钟，速度为9000g

14.移取上清液到2个新的1.5毫升离心管

15.放进4℃超速离心机离心60分钟，速度为100000g

16.小心抽去上清液

17.分别加入xx微升裂解液（Reagent B）

18.合并到1个1.5毫升离心管

19.移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）

20.即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

二、测定准备

1．准备好待测样品（例如细胞裂解萃取液或微粒体样品等），置于冰槽里

2．设定好分光光度仪（温度为30℃）：波长为550nm，间隔60秒，读数6次（共5分钟），并置零

三、背景对照测定

1．移取xx微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿

2．加入xx微升反应液（Reagent D）

3．加入xx微升底物液（Reagent E）

4．放进30℃培养箱里静置3分钟

5．加入xx微升阴性液（Reagent F）

6．上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）

7．即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照：550波长读数5分钟－550波长读数0分钟 

四、样品活性测定

1．移取xx微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿

2．加入xx微升反应液（Reagent D）

3．加入xx微升底物液（Reagent E）

4．放进30℃培养箱里静置3分钟

5．加入50微升待测样品（注意：100微克微粒体蛋白；样品须溶解；参见注意事项10）

6．上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）

7．即刻放进分光光度仪检测，此为样品活性读数：550波长读数5分钟－550波长读数0分钟

五、计算样品活性

注意事项

1．本产品为20次（比色皿）操作，包括背景对照

2．操作时，须戴手套

3．系统操作过程中，背景测定只需1次

4．样品须澄清，至关重要 

5．加入样品启动反应后3秒内即刻比色测定

6．分光光度计波长严格设置在550nm，误差10nm将不产生信号

7．测定值由低到高变化；测定可以持续5分钟

8．测定值由低到高变化，即5分钟测定读数高于0分钟测定读数，表明有酶活性

9．比色测定后，比色皿须清洗*

10．建议待测样本为微粒体，其蛋白浓度为100微克/50微升；待测样本为组织裂解悬液，其总蛋白浓度为250至500微克/50微升（本公司提供  Bradford蛋白质浓度定量试剂盒30030.1） 

11．如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度

12．通常每毫克肝组织蛋白含有1至5毫单位NADPH细胞色素C还原酶

13．NADPH细胞色素C还原酶单位活性定义为：在30℃，pH 7.8条件下，每分钟内能够还原1微摩尔细胞色素C所需的酶量作为一个活性单位

14．本公司提供系列NADPH细胞色素C还原酶检测试剂产品

质量标准

1．本产品经鉴定性能稳定

2．本产品经鉴定检测敏感