革兰氏阴性细菌外膜囊泡制备试剂盒产品说明书 

主要用途

革兰氏阴性细菌外膜囊泡制备试剂是一种旨在使用差速离心，分离并收集所有细胞外膜囊泡的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。适合于各种革兰氏阴性细菌外膜囊泡及其蛋白的纯化。产品即到即用，性能稳定，操作便捷，萃取产量和纯度皆佳。

技术背景

外膜囊泡（outer membrane vesicle；OMV）为含有周质内容物（包括外膜蛋白、DNA、RNA、脂多糖、脂质、周质蛋白、黏附素、免疫调节化合物等）的球形电子致密芽状体（spherical bud），细胞外间隔体，双层磷脂，20至200纳米大小，来自于革兰氏阴性细菌周边突起物的释放形成或胞外分泌产物，使之与环境或宿主细胞进行反应，并调解各种功能，包括促进病理形成，调节细菌互动，转运各种信号分子（例如DNA、RNA、蛋白质、内毒素、毒力因子等），保护细菌生存、结合和侵入，引起毒性，产生抗生素抗性等。外膜囊泡的产量取决于细菌生长周期、营养条件、温度、氧化应激状态等。病原菌的外膜囊泡10倍于非病原菌体。外膜囊泡具有疫苗开发中免疫调节潜力。通过差速离心和蛋白酶抑制混合剂，获得高纯外膜囊泡，充分保留其蛋白质的免疫和生物学活性。

产品内容

保存液（Reagent A）        毫升

溶解液（Reagent B）        毫升

活性液（Reagent C）        微升

产品说明书   1份

保存方式

保存活性液（Reagent C）在-20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，有效保证6月

用户自备

50毫升锥形离心管：用于样品操作的容器

1.5毫升离心管：用于样品保存的容器

分光光度仪：用于测定细菌浓度

台式离心机：用于样品操作

超速离心机：用于样品操作

恒温摇床：用于培养细菌细胞

0.45微米滤膜：用于样品操作

真空浓缩装置：用于样品操作

实验步骤 

实验开始前，将试剂盒里的活性液（Reagent C）从－20℃的冰箱里取出，置入冰槽里冻融，然后移出xx毫升溶解液（Reagent B）到1.5毫升离心管，加入xx微升活性液（Reagent C），充分混匀，置于冰槽里，标记为溶解工作液。然后进行下列操作。

• 准备好1毫升过夜培养的新鲜细菌样品
• 移取500微升到50毫升细菌培养液（注意：用户可以进行诱导培养，例如无铁培养等）
• 放进37℃恒温摇床孵育过夜，速度为200RPM
• 在分光光度仪上测OD600为1（1 OD＝1 X 10⁹细胞/毫升；总量为5 X 10¹⁰细胞） 
• 转移到预冷的50毫升锥形离心管
• 放进4℃台式离心机离心30分钟，速度为5000g
• 小心移取上清液到新的50毫升锥形离心管
• 重复实验步骤6和7一次
• 使用0.45微米滤膜真空过滤一次
• （选择步骤）使用100kD蛋白临界点浓缩处理
• 放进4℃超速离心机离心3小时，速度为150000g
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升预冷的保存液（Reagent A）
• 或加入xx微升预冷的含有 溶解液（Reagent B）和活性液（Reagent C）的溶解工作液
• 用枪头上下抽吸，充分混匀
• 转移到到新的预冷的1.5毫升离心管
• 即刻放进－70℃冰箱里保存或置于冰冰槽里备用
• 进行后续蛋白定量、荧光定量或电镜检测等

注意事项

• 本产品为20次（50毫升菌液）操作
• 所有操作须在4℃状态下进行
• 建议使用新鲜细菌接种，培养到指数生长阶段为理想状态
• 活性液（Reagent C）避免反复冻融
• 本产品按照50毫升培养菌液配制。如果操作不同菌液容量，可相应调整试剂用量
• 根据菌种不同，50毫升（OD600＝1）菌液可获得5至100微克外膜囊泡蛋白
• 制备产物如果放在－70℃冰箱里储存备用，严格避免反复冻融
• 本公司提供系列细菌试剂产品
    

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定无蛋白酶污染